Geboren und aufgewachsen in England, trat John Mahoney Ende der 1950er Jahre in die United States Army ein und wanderte in die Vereinigten Staaten aus. Nach akademischen und publizistischen Tätigkeiten wandte er sich erst im Alter von 37 Jahren der Schauspielerei zu, zunächst als Theaterschauspieler. 1977 wurde er Mitglied der Steppenwolf Theatre Company.
Mahoneys bekannteste Rolle ist die des Martin Crane in der Fernsehserie Frasier, in der er von 1993 bis 2004 den Vater der Titelfigur spielte, einen pensionierten, gehbehinderten Polizisten, der Leben und Wohnung mit seinem Sohn teilt, mit dem er wenig gemeinsam hat. Für diese Rolle wurde Mahoney mehrfach für den Emmy und den Golden Globe nominiert. Zudem spielte er in der Folge „Zwischen Himmel und Hölle“ (Staffel 2, Episode 22) der Sitcom Becker einen Pater und den Bruder eines Patienten von Dr. John Becker (gespielt von Ted Danson). In der zweiten Staffel der Serie In Treatment – Der Therapeut (2009) spielte Mahoney in den Episoden 2.04 bis 2.34 die wiederkehrende Rolle des Geschäftsführers eines Industriekonzerns. 2010 war er in Rob Reiners Film Verliebt und ausgeflippt zu sehen.
Parallel zur Film- und Fernseharbeit spielte Mahoney weiter am Theater und gewann unter anderem 1986 einen Tony Award für seine Darstellung im Stück The House of Blue Leaves. Nach dem Ende von Frasier war Mahoney wieder vorwiegend am Theater tätig.
Mahoney starb im Alter von 77 Jahren während eines Krankenhausaufenthalts in Chicago.
Filmografie (Auswahl)
John Mahoney (2007)
1981: Hudson Taylor
1982: Nixons rechte Hand – Der Fall G. Gordon Liddy (Will: The Autobiography of G. Gordon Liddy, Fernsehfilm)