Limiting Dilution Cloning

Das Limiting Dilution Cloning (zu deutsch Grenzverdünnungsklonen) ist eine Methode zur Vereinzelung eines Klons. Mit dem Klon kann eine monoklonale Zellkultur begonnen werden.

Prinzip

Das Limiting Dilution Cloning basiert auf der Verdünnung einer Suspension von Zellen in mehreren Verdünnungsstufen bis hin zur Grenzverdünnung, bei der statistisch nur eine oder gar keine Zellen in einer Verdünnungsstufe vorhanden sind. Durch die isolierte Kultivierung dieser einzelnen Zelle sind alle daraus entstehenden Tochterzellen genetisch identische Klone. Bei tierischen Zellen ist oftmals die gleichzeitige Verwendung von Fütterzellen notwendig. Gewebszellen besitzen als adhärente Zellen Zell-Zell-Kontakte, die vor einer Vereinzelung z. B. mit Trypsin gelöst werden.

Klonen anhand der Grenzverdünnung erfolgt zur Vereinzelung von Zellen, z. B. bei Hybridomata, bei transgenen Organismen nach einer Klonierung, bei induzierten pluripotenten Stammzellen, bei Parasiten, bei T-Zellen, oder bei Makrophagen.

Alternativen zur Isolierung anhand der Grenzverdünnung sind z. B. FACS, MACS oder eine manuelle Vereinzelung mit Mikrokapillaren unter einem Inversmikroskop.

Literatur

• Friedrich Lottspeich, Joachim W. Engels, Solodkoff Zettlmeier Lay: Bioanalytik. 3. Auflage, Spektrum, Heidelberg, 2012, ISBN 978-3-8274-0041-3.
• Cornel Mülhardt: Der Experimentator: Molekularbiologie/Genomics. Sechste Auflage. Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg 2008, ISBN 3-8274-2036-9.
• J. Sambrook, T. Maniatis, D. W. Russel: Molecular cloning: a laboratory manual. 3rd edition (2001), Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-577-3.
• R. Staszewski: Cloning by limiting dilution: an improved estimate that an interesting culture is monoclonal. In: The Yale journal of biology and medicine. Band 57, Nummer 6, 1984 Nov–Dec, S. 865–868, PMID 6537695, PMC 2589791 (freier Volltext).

Weblinks

• John A. Ryan: Cell Cloning by Serial Dilution in 96 Well Plates. (PDF-Datei)
• Vilma Maldonado, Jorge Meléndez-Zajgla: A modified method for cloning adherent mammalian cells.
• Cloning by limiting dilution.
• Nanci Donacki Cloning by Limiting Dilution of Hybridoma.

Einzelnachweise

1. ↑ R. Ian Freshney: Culture of animal cells: a manual of basic technique and specialized applications. 6. Auflage. Wiley-Blackwell, Hoboken, N.J. 2010, ISBN 978-0-470-52812-9, S. 208–211 (englisch). 
2. ↑ edited by John M Davis: Animal cell culture. Wiley-Blackwell, Oxford 2011, ISBN 978-0-470-66658-6, S. 239–240 (englisch). 
3. ↑ Benjamin G. Lilienfeld, Crew, Mark D., Forte, Pietro, Baumann, Bettina C., Seebach, Jörg D.: Transgenic expression of HLA-E single chain trimer protects porcine endothelial cells against human natural killer cell-mediated cytotoxicity. In: Xenotransplantation. 14. Jahrgang, Nr. 2, 1. März 2007, S. 126–134, doi:10.1111/j.1399-3089.2007.00378.x (englisch). 
4. ↑ Alice S Butterworth, Robertson, Alan J, Ho, Mei-Fong, Gatton, Michelle L, McCarthy, James S, Trenholme, Katharine R: An improved method for undertaking limiting dilution assays for in vitro cloning of Plasmodium falciparum parasites. In: Malaria Journal. 10. Jahrgang, Nr. 1, 1. Januar 2011, S. 95, doi:10.1186/1475-2875-10-95 (englisch). 
5. ↑ Namita Rout, Else, James G., Yue, Simon, Connole, Michelle, Exley, Mark A., Kaur, Amitinder: Heterogeneity in phenotype and function of CD8+ and CD4/CD8 double-negative Natural Killer T cell subsets in sooty mangabeys. In: Journal of Medical Primatology. 39. Jahrgang, Nr. 4, 2. Juli 2010, S. 224–234, doi:10.1111/j.1600-0684.2010.00431.x (englisch). 
6. ↑ Yoshihiro Seki, Suzuki, Satoshi O., Masui, Kenta, Harada, Shiori, Nakamura, Seiji, Kanba, Shigenobu, Iwaki, Toru: A simple and high-yield method for preparation of rat microglial cultures utilizing Aclar plastic film. In: Neuropathology. 31. Jahrgang, Nr. 3, 1. Juni 2011, S. 215–222, doi:10.1111/j.1440-1789.2010.01163.x (englisch).