Matthew Del Negro wurde als jüngstes von drei Kindern in Mount Kisco geboren. Er schloss das Boston College erfolgreich ab und spielte während dieser Zeit Lacrosse.
Nach dem Abschluss studierte er Schauspiel und trat zunächst in Werbespots und Independentfilmen auf. Seit 1997 ist er als Schauspieler aktiv. Nach einigen Serienauftritten wurde er 2002 in der Rolle des Brian Cammarata in der Serie Die Sopranos gecastet. Weitere wiederkehrende Rollen folgten in The West Wing – Im Zentrum der Macht und Beautiful People. In der Folge absolvierte er vor allem Gastauftritte in bekannten US-Serien, wie CSI: Miami, Parenthood, Good Wife, Criminal Minds, Rizzoli & Isles oder Navy CIS: L.A. Von 2013 bis 2017 war er als Rafael McCall in einer Nebenrolle in Teen Wolf zu sehen. Ein Jahr darauf übernahm er als Michael Ambruso eine Rolle in Scandal, die er ebenfalls bis 2017 darstellte.