Molecular Combing

Molecular Combing (engl., synonym chromosome combing, zu deutsch etwa ‚molekulares Kämmen‘) ist eine biochemische und biophysikalische Methode zur Ausrichtung und Dehnung von Polymeren wie chromosomale DNA.

Prinzip

Die chromosomale DNA wird an einer Oberfläche befestigt, z. B. durch Hybridisierung an befestigte Oligonukleotide oder durch kovalente Bindung an eine silanisierte Oberfläche, z. B. ein Deckglas. Durch Absenken eines Meniskus bei einer Geschwindigkeit von etwa 300 μm/s wird die DNA ausgerichtet. Die DNA verbleibt bevorzugt in der flüssigen Phase. Die Zugkräfte des sinkenden Meniskus sind geringer als die Kräfte der Hybridisierung, weshalb die DNA an der Oberfläche gebunden bleibt und ausgerichtet und gedehnt wird. Dabei wird die DNA auf etwa 2 kb/μm gedehnt (150 % der Konturlänge eines random coil, aufgrund einer Kraft von 65 pN), wodurch sich in folgenden mikroskopischen Betrachtungen eine verbesserte Auflösung ergibt.

Das molecular combing wird unter anderem bei der Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) verwendet. Durch molekulares Kämmen ergibt sich in der FISH eine Auflösung von 300 bp.

Anwendungen

Aufgrund der verbesserten Auflösung kann per FISH z. B. die Geschwindigkeit der Replikationsgabel beim Einbau von BrdU gemessen werden, die Länge von DNA exakter bestimmt werden oder instabile Chromosomen (z. B. bei Krebs) untersucht werden.

Einzelnachweise

  1. 1 2 A. Bensimon, A. Simon, A. Chiffaudel, V. Croquette, F. Heslot, D. Bensimon: Alignment and sensitive detection of DNA by a moving interface. In: Science. Band 265, Nummer 5181, September 1994, ISSN 0036-8075, S. 2096–2098, PMID 7522347.
  2. 1 2 R. Lebofsky, A. Bensimon: Single DNA molecule analysis: applications of molecular combing. In: Briefings in functional genomics & proteomics. Band 1, Nummer 4, Januar 2003, ISSN 1473-9550, S. 385–396, PMID 15239885.
  3. ↑ X. Michalet, R. Ekong, F. Fougerousse, S. Rousseaux, C. Schurra, N. Hornigold, M. van Slegtenhorst, J. Wolfe, S. Povey, J. S. Beckmann, A. Bensimon: Dynamic molecular combing: stretching the whole human genome for high-resolution studies. In: Science. Band 277, Nummer 5331, September 1997, ISSN 0036-8075, S. 1518–1523, PMID 9278517.
  4. 1 2 N. Ohmido, K. Fukui, T. Kinoshita: Recent advances in rice genome and chromosome structure research by fluorescence in situ hybridization (FISH). In: Proceedings of the Japan Academy. Series B, Physical and biological sciences. Band 86, Nummer 2, 2010, ISSN 1349-2896, S. 103–116, PMID 20154468, PMC 3417561 (freier Volltext).
  5. ↑ C. Conti, B. Saccà, J. Herrick, C. Lalou, Y. Pommier, A. Bensimon: Replication fork velocities at adjacent replication origins are coordinately modified during DNA replication in human cells. In: Molecular biology of the cell. Band 18, Nummer 8, August 2007, ISSN 1059-1524, S. 3059–3067, doi:10.1091/mbc.E06-08-0689, PMID 17522385, PMC 1949372 (freier Volltext).
  6. ↑ J. Herrick, A. Bensimon: Introduction to molecular combing: genomics, DNA replication, and cancer. In: Methods in Molecular Biology. Band 521, 2009, ISSN 1064-3745, S. 71–101, doi:10.1007/978-1-60327-815-7_5, PMID 19563102.