Cryo-elektronenmicroscopie, vaak afgekort als cryo-EM, is een moderne vorm van elektronenmicroscopie waarbij het te bestuderen materiaal wordt afgekoeld tot zeer lage – cryogene – temperaturen. Biologische structuren, zoals eiwitcomplexen, membraaneiwitten, of hele virusdeeltjes, worden hierbij extreem snel afgekoeld tot een toestand van glasachtig ijs (vitreous ice). Dit gebeurt zo snel, dat de watermoleculen in het preparaat geen tijd hebben om kristallen te vormen, zodat de structuren in hun oorspronkelijke, driedimensionale staat bekeken kunnen worden.
Cryo-EM heeft een zeer hoog oplossend vermogen (resolutie). Het laat toe dat structuren in beeld gebracht kunnen worden met een atomaire resolutie. De techniek is in de structuurbiologie in de belangstelling gekomen als een krachtig alternatief voor röntgenkristallografie en NMR-spectroscopie; twee oudere technieken die gebruikt worden voor ontrafeling van de macromoleculaire structuur. Cryo-EM werd in 2015 uitgeroepen tot 'Methode van het Jaar' door het blad Nature Methods, en twee jaar later bekroond met de Nobelprijs voor Scheikunde.
De elektronenmicroscopie is al een oude techniek die in de jaren 1930 werd ontwikkeld, en snel werd toegepast op biologische preparaten. Hiermee konden onderzoekers op een geheel nieuwe manier de ultrastructuur van cellen, organellen en virussen bestuderen. Een nadeel was echter dat biologische monsters chemisch moesten worden gefixeerd, gedehydrateerd en behandeld met zware metalen om ze zichtbaar te maken. Deze bewerkingen kunnen zogeheten artefacten introduceren: dat wil zeggen dat de natuurlijke structuur van de macromoleculen worden vervormd.
Om dit probleem op te lossen, ontwikkelde de Zwitserse biofysicus Jacques Dubochet in de jaren 1980 een vernieuwende methode voor preparaatvoorbereiding. Hij ontdekte een techniek om een biologisch monster zeer snel af te koelen (ruim 105 K/s) door onderdompeling in vloeibaar ethaan. Hierdoor krijgen de aanwezige watermoleculen geen tijd om een kristalrooster te vormen. Het water gaat over in een bijzondere vaste toestand: amorf, glasachtig ijs (vitrificatie). Hierdoor blijft de structuur van het biomolecuul in zijn natuurlijke (native) ruimtelijke toestand. In 1984 publiceerde Dubochet de eerste succesvolle beelden van bevroren virussen.
Rond ongeveer dezelfde tijd vonden er grote doorbraken plaats op het gebied van beeldverwerking en structuurbepaling. In 1975 slaagden Richard Henderson en Nigel Unwin erin om de driedimensionale structuur van het membraaneiwit bacteriorodopsine te bepalen (met een resolutie van 7 Å). Deze prestatie bewees voor het eerst dat elektronenmicroscopie een volwaardig instrument kon zijn voor de structuurbiologie, een vakgebied dat tot dan toe werd gedomineerd door röntgenkristallografie.
Latere ontwikkelingen
Ondanks deze ontwikkelingen bleef de resolutie van cryo-EM lange tijd beperkt. Sommige onderzoekers spraken gekscherend van 'blobology', omdat de beelden er korrelig uitzagen. Alleen de globale vorm van een eiwitmolecuul kon worden bepaald, maar afzonderlijke atomen en secundaire structuren waren niet of nauwelijks te onderscheiden.
Vanaf ongeveer 2012 volgden sterke technologische verfijningen. De introductie van direct electron detectors maakte het mogelijk om met veel grotere gevoeligheid en snelheid beelden vast te leggen. Kleine bewegingen van moleculen tijdens de opname konden achteraf computationeel worden gecorrigeerd. In combinatie met krachtigere computers en verbeterde beeldverwerkingssoftware (bijvoorbeeld RELION, ontwikkeld door de Nederlandse structuurbioloog Sjors Scheres) werd het mogelijk om een uitzonderlijke resolutie te bereiken: minder dan 0,12 nm (1,2 Å) bij stabiele eiwitten. Dit is scherp genoeg om zijketens en zelfs individuele atomen te zien; de omwenteling werd aangeduid als de resolution revolution.
Werking
Preparaatvoorbereiding
Stappenplan voor het bepalen van de ruimtelijke structuur van biologische monsters met cryo-EM
Bij cryo-EM wordt het te bestuderen onderzoeksmonster, bijvoorbeeld een gezuiverd eiwitcomplex of virusdeeltje, aangebracht op een dun microscopisch raster. Dit raster wordt met grote snelheid ondergedompeld (plunge-frozen) in vloeibaar ethaan, dat gekoeld wordt door vloeibare stikstof. Het bevroren preparaat wordt vervolgens bij ongeveer -180 °C overgezet in een transmissie-elektronenmicroscoop.
Beeldvorming
In de microscoop wordt het preparaat blootgesteld aan een bundel elektronen, doorgaans met een acceleratievoltage van 300.000 V. De elektronen worden door de aanwezige moleculen verstrooid, waardoor een schaduwbeeld op de detector ontstaat. Een belangrijke overweging hierbij is dat de elektronenbundel de biomoleculen kan beschadigen. Daarom wordt een uiterst lage elektronendosis gebruikt, met als gevolg dat de verkregen opnamen weinig contrast hebben en vrij veel ruis bevatten.
Om ondanks die ruis toch voldoende informatie te verzamelen, worden grote aantallen opnamen van hetzelfde molecuul gemaakt. Bij de veelgebruikte single-particle-methode liggen deze moleculen in verschillende, willekeurige oriëntaties in het ijs. Hierdoor ontstaan tweedimensionale projecties van hetzelfde molecuul vanuit verschillende richtingen. Moderne directe elektronendetectoren kunnen bovendien korte reeksen beelden vastleggen, waardoor kleine bewegingen tijdens de opname achteraf kunnen worden gecorrigeerd.
Driedimensionale reconstructie
Met gespecialiseerde software worden vervolgens tienduizenden tot miljoenen afzonderlijke beelden geanalyseerd. De beelden worden geselecteerd, op basis van overeenkomsten gegroepeerd en ten opzichte van elkaar uitgelijnd. Door de informatie uit verschillende aanzichten te combineren, kan een driedimensionale dichtheidskaart (density map) van het molecuul worden berekend. Dit wordt single-particle reconstruction genoemd. Een veelgebruikt programma hiervoor is RELION, dat statistische methoden gebruikt om de oriëntaties van moleculen te bepalen en de reconstructie te verfijnen.
De dichtheidskaart laat zien hoe de structuur van het molecuul ruimtelijk is opgebouwd. Bij voldoende hoge resolutie kunnen onderzoekers hierin de eiwitruggengraat en afzonderlijke aminozuurzijketens herkennen. Aan de hand van de bekende aminozuurvolgorde kan vervolgens een atomair model (vaak getekend als lintdiagram) worden opgebouwd.
Ruimtelijke structuur van een eiwitcomplex van een virus, bepaald met cryo-elektronenmicroscopie. (a) De gereconstrueerde dichtheidskaart toont drie eiwitketens, elk in een andere kleur, vanuit twee kijkhoeken. (b) Detailweergave waarin afzonderlijke aminozuren zichtbaar zijn. (c) Moleculair model van het complex, opgebouwd aan de hand van de dichtheidskaart. (d) Detail van het omcirkelde gebied.
↑(en) Dubochet J.(2016).A Reminiscence about Early Times of Vitreous Water in Electron Cryomicroscopy. Biophysical Journal110(4): 756-757. DOI: 10.1016/j.bpj.2015.07.049.
↑(en) Nakane T, Kotecha A, Sente A, Mcmullan G, Masiulis S, Brown PMGE, Grigoras IT, et al.(2020).Single-particle cryo-EM at atomic resolution. Nature587(7832): 152-156. DOI: 10.1038/s41586-020-2829-0.
↑(en) Merk A, Bartesaghi A, Banerjee S, Falconieri V, Rao P, Davis MI, Pragani R, et al.(2016).Breaking Cryo-EM Resolution Barriers to Facilitate Drug Discovery. Cell165(7): 1698-1707. DOI: 10.1016/j.cell.2016.05.040.
↑(en) Zivanov J, Otón J, Ke Z, Von Kügelgen A, Pyle E, Qu K, Morado D, et al.(2022).A Bayesian approach to single-particle electron cryo-tomography in RELION-4.0. eLife11. DOI: 10.7554/eLife.83724.
