Een gramkleuring van Staphylococcus aureus (grampositieve kokken, paars) en Escherichia coli (gramnegatieve bacillen, rood); veelgebruikte referentiebacteriën.
Gramkleuring is een methode om bacteriën te kleuren om ze onder een lichtmicroscoop zichtbaar te maken en als hulpmiddel bij het herkennen van soorten. Met behulp van gramkleuring vallen bacteriën uiteen in twee verschillend aankleurende groepen, die men gramnegatief (rood) of grampositief (blauwpaars) noemt. De methode is genoemd naar de uitvinder ervan, de Deense microbioloog Hans Christian Gram (1853-1938), die de techniek in 1884 ontwikkelde voor het onderscheiden van pneumokokken (Streptococcus pneumoniae) van Klebsiella pneumoniae.
Gramkleuring van bacteriën is mogelijk door de verschillende chemische en fysische eigenschappen van hun celwanden. Grampositieve cellen hebben een dikke laag peptidoglycaan in hun celwand die de kleurstof kristalviolet gemakkelijk opneemt. Gramnegatieve cellen hebben een dunnere peptidoglycaanlaag waardoor het kristalviolet kan worden uitgewassen. Deze bacteriën worden roze gekleurd door een tegenkleuring, gewoonlijk met safranine of fuchsine.
Sommige bacteriën vertonen na kleuring met de gramkleuring een gram-variabel patroon: een mengsel van roze en paarse cellen is te zien. In culturen van Bacillus, Butyrivibrio en Clostridium valt een afname van de peptidoglycaandikte tijdens de groei samen met een toename van het aantal cellen dat gram-negatief kleurt. Bovendien kan bij alle bacteriën die met de gramkleuring worden gekleurd, de leeftijd van de cultuur de resultaten van de kleuring beïnvloeden.
Gram-onbepaalde bacteriën reageren niet voorspelbaar op gramkleuring en kunnen daarom niet als gram-positief of gram-negatief worden bepaald. Voorbeelden hiervan zijn veel soorten Mycobacterium, waaronder Mycobacterium bovis, Mycobacterium leprae en Mycobacterium tuberculosis, waarvan de laatste twee respectievelijk de verwekkers zijn van lepra en tuberculose. Bacteriën van het geslacht Mycoplasma missen een celwand rond hun celmembranen, waardoor ze niet kleuren met de gram-kleuring en resistent zijn tegen antibiotica die de celwandsynthese remmen.
Werking
De bacteriën worden eerst gekleurd met een kristalviolet-jodium-complex, daarna gewassen met alcohol en vervolgens nagekleurd met waterige fuchsine. Bij grampositieve bacteriën wordt het kristalviolet-jodiumcomplex niet weggewassen door de alcohol; deze cellen kleuren blauwpaars. Gramnegatieve cellen verliezen de eerste kleurstof weer door het alcoholbad; door de nakleuring met fuchsine kleuren ze daarna rood. Van belang is wel, dat voor de gramkleuring enkel bacteriën worden gebruikt uit een 24 uur oude cultuur, omdat in oudere culturen gramvariabiliteit kan optreden.
Verklaring
Het verschil tussen gramnegatieve en grampositieve bacteriën wordt veroorzaakt door een verschil in de structuur van de celwand:
Grampositieve bacteriën hebben een dikke peptidoglycaanlaag die ondoordringbaar is voor het alcoholmengsel, waardoor deze niet worden ontkleurd.
Gramnegatieve cellen hebben buiten het cytoplasmamembraan een heel dunne peptidoglycaanlaag.
Bouw van een gramnegatieve celwand
Buiten de dunne laag peptidoglycaan zit nog een tweede membraan. Dat buitenmembraan bevat lipopolysacchariden (kortweg LPS), die de cel een extra bescherming bieden. Dit lipopolysacharidemembraan is op te delen in 2 soorten:
het kernlipopolysacharidemembraan
het O-lipopolysacharidemembraan
de celwand bevat verschillende antigenen:
H-antigenen: flagellen
O-antigenen: celwand
K-antigenen: koolhydraat kapsel
Het kernlipopolysacharidemembraan zit dichter op de bacterie terwijl het O-lipopolysacharidemembraan de buitenste buitenkant is van elke gramnegatieve bacterie.
De celwand van gramnegatieve bacteriën verliest het kristal-violet van de eerste kleuring bij het spoelen met alcohol weer en kleurt rood, terwijl die van de grampositieve het kristalviolet wel permanent absorbeert ten gevolge van een bindingsreactie met de lugol, waardoor de bacteriën de paars-blauwe kleur vasthouden.
Uitvoering
Markeer de bovenkant van een voorwerpglaasje met een krasstaafje.
Breng op een voorwerpglas met behulp van een entoog een druppel steriel fysiologisch water (0,9% NaCl) en strijk deze uit (fysiologisch water is alleen nodig in geval van een 'vaste bacteriecultuur').
Suspendeer een zeer geringe hoeveelheid bacteriemateriaal in de druppel en strijk deze uit over het glas (over een oppervlak van ongeveer een euro).
Laat drogen aan de lucht (of hoog boven de vlam).
Fixeer door driemaal kort door de vlam te halen en laat afkoelen.
Kleur het preparaat minstens 1 minuut met kristalvioletoplossing en spoel daarna voorzichtig met water.
Spoel goed met water, vloei voorzichtig af tussen filtreerpapier en laat het preparaat drogen aan de lucht. Het kan dan onder de microscoop met olie-immersie worden bekeken (geen dekglaasje!).
Klinisch belang
Het maakt voor het beloop van de ziekte en de keuze van de behandeling verschil of de infectie door een grampositieve of een gramnegatieve bacterie veroorzaakt wordt.
Over het algemeen treedt penicillineresistentie (ongevoeligheid) bij grampositieve bacteriën minder op dan bij gramnegatieve, tenzij ze het enzym bètalactamase kunnen produceren. Bij resistentie ligt een lactamaseresistent smalspectrumpenicilline als flucloxacilline of toevoeging van de lactamaseremmer clavulaanzuur meer voor de hand dan breedspectrum penicillines als amoxicilline.
Gramnegatieve bacteriën zorgen met hun LPS-laag dat het menselijk immuunsysteem sterk reageert op penicilline; de dode bacteriën zijn zelf een endotoxine waar je ziek van kunt worden. Een exotoxine is een gifstof die een (meestal grampositieve) bacterie (zoals de difterie- of de tetanusbacterie of ook Staphylococcus aureus) produceert.
Voorbeelden
Tabel met voorbeelden van grampositieve en gramnegatieve bacteriën:
↑Tim, Sandle(21 October 2015).Pharmaceutical Microbiology: Essentials for Quality Assurance and Quality Control. Elsevier Science.ISBN 978-0-08-100022-9.
