Espectroscopia de fluorescência

A espectroscopia de fluorescência, também chamada fluorimetria ou espectrofluorometria, é um tipo de espectroscopia eletromagnética que analisa a fluorescência de uma amostra. A técnica emprega um feixe de luz, geralmente ultravioleta, que excita os elétrons em moléculas de determinados compostos e faz com que emitam luz, em geral, embora não necessariamente, luz visível. Uma técnica complementar é a espectroscopia de absorção. No caso particular da espectroscopia de fluorescência de molécula única, medem-se as flutuações de intensidade da luz emitida por fluoróforos individuais ou por pares de fluoróforos.

Os aparelhos usados para medir fluorescência são chamados fluorímetros ou fluorômetros.

Teoria

As moléculas apresentam diferentes estados, chamados níveis de energia. A espectroscopia de fluorescência ocupa-se principalmente dos estados eletrônicos e vibracionais. Em geral, a espécie examinada possui um estado eletrônico fundamental, de baixa energia, e um estado eletrônico excitado, de energia mais alta. Dentro de cada um desses estados eletrônicos existem diferentes estados vibracionais.

Na fluorescência, a espécie é primeiro excitada pela absorção de um fóton, passando do estado eletrônico fundamental para um dos estados vibracionais do estado eletrônico excitado. Colisões com outras moléculas fazem a molécula excitada perder energia vibracional até atingir o estado vibracional mais baixo do estado eletrônico excitado. Esse processo costuma ser representado por um diagrama de Jablonski.

A molécula então retorna a um dos diferentes níveis vibracionais do estado eletrônico fundamental e emite um fóton nesse processo. Como as moléculas podem retornar a qualquer um dos níveis vibracionais do estado fundamental, os fótons emitidos apresentam energias diferentes e, com elas, frequências diferentes. A análise das diferentes frequências da luz emitida na espectroscopia de fluorescência, juntamente com suas intensidades relativas, permite determinar a estrutura dos diferentes níveis vibracionais.

Para espécies atômicas, o processo é semelhante. Como os átomos não possuem níveis de energia vibracional, porém, os fótons emitidos costumam ter o mesmo comprimento de onda da radiação incidente. Esse processo de reemissão do fóton absorvido é chamado "fluorescência de ressonância". Embora seja característico da fluorescência atômica, também ocorre na fluorescência molecular.

Em uma medição típica de fluorescência por emissão, o comprimento de onda de excitação, isto é, o comprimento de onda da luz incidente usada para excitar o fluoróforo, permanece fixo, enquanto o comprimento de onda de detecção varia, produzindo um espectro de emissão. Em uma medição de excitação de fluorescência, o comprimento de onda de detecção permanece fixo e o comprimento de onda de excitação varia ao longo de uma região de interesse, produzindo um espectro de excitação. Uma matriz de excitação-emissão é obtida registrando-se os espectros de emissão resultantes de uma faixa de comprimentos de onda de excitação e combinando-os. O resultado é um conjunto de dados de superfície tridimensional, no qual a intensidade de emissão é expressa em função dos comprimentos de onda de excitação e de emissão, geralmente representado como um mapa de contorno.

Instrumentação

Existem dois tipos gerais de instrumentos: fluorímetros de filtro, que usam filtros para isolar a luz incidente e a luz fluorescente, e espectrofluorímetros, que usam monocromadores com redes de difração para isolar a luz incidente e a luz fluorescente.

Os dois tipos seguem o mesmo esquema. A luz de uma fonte de excitação passa por um filtro ou monocromador e atinge a amostra. Uma parte da luz incidente é absorvida pela amostra e algumas de suas moléculas fluorescem. A luz fluorescente é emitida em todas as direções. Parte dela atravessa um segundo filtro ou monocromador e chega a um detector, que normalmente é colocado a 90° do feixe de luz incidente para reduzir o risco de que a luz incidente transmitida ou refletida alcance o detector.

Diferentes fontes de luz podem ser usadas para excitação, entre elas lasers, LED e lâmpadas, em especial arcos de xenônio e lâmpadas de vapor de mercúrio. Um laser emite luz de alta irradiância em um intervalo muito estreito de comprimentos de onda, geralmente inferior a 0,01 nm, o que torna desnecessário um monocromador ou filtro de excitação. A desvantagem desse método é que o comprimento de onda de um laser não pode ser alterado em grande escala. Uma lâmpada de vapor de mercúrio é uma lâmpada de linhas, ou seja, emite luz próxima a comprimentos de onda de pico. Um arco de xenônio possui espectro de emissão contínuo com intensidade quase constante entre 300 e 800 nm e irradiância suficiente para medições até pouco acima de 200 nm.

Filtros e monocromadores podem ser usados em fluorímetros. Um monocromador transmite luz de comprimento de onda ajustável, com tolerância também ajustável. O tipo mais comum emprega uma rede de difração. A luz colimada ilumina a rede e sai em um ângulo diferente conforme o comprimento de onda. O monocromador pode então ser ajustado para selecionar os comprimentos de onda transmitidos. Para medições de anisotropia, é necessário acrescentar dois filtros de polarização, um após o monocromador ou filtro de excitação e outro antes do monocromador ou filtro de emissão.

A fluorescência é medida com maior frequência em um ângulo de 90° em relação à luz de excitação. Essa geometria é usada em vez de colocar o sensor na linha da luz de excitação, a 180°, para evitar a interferência da luz de excitação transmitida. Nenhum monocromador é perfeito e sempre transmite alguma luz espúria, isto é, luz em comprimentos de onda diferentes dos desejados. Um monocromador ideal transmitiria apenas a luz no intervalo especificado e teria alta transmissão independente do comprimento de onda. Quando a medição é feita a 90°, apenas a luz espalhada pela amostra produz luz espúria. Isso melhora a relação sinal-ruído e reduz o limite de detecção em aproximadamente um fator de 10.000, em comparação com a geometria de 180°. A fluorescência também pode ser medida pela face frontal da amostra, procedimento comum em amostras turvas ou opacas.

O detector pode ser de canal único ou multicanal. O detector de canal único só consegue medir a intensidade de um comprimento de onda por vez, enquanto o detector multicanal mede simultaneamente a intensidade de todos os comprimentos de onda, tornando desnecessário o monocromador ou filtro de emissão.

Os fluorímetros mais versáteis, equipados com dois monocromadores e uma fonte contínua de luz de excitação, podem registrar tanto um espectro de excitação quanto um espectro de fluorescência. Na medição de espectros de fluorescência, o comprimento de onda da luz de excitação é mantido constante, de preferência em um comprimento de onda de alta absorção, enquanto o monocromador de emissão varre o espectro. Na medição de espectros de excitação, o comprimento de onda que passa pelo filtro ou monocromador de emissão é mantido constante, enquanto o monocromador de excitação faz a varredura. O espectro de excitação geralmente é idêntico ao espectro de absorção, pois a intensidade da fluorescência é proporcional à absorção.

Análise de dados

Em baixas concentrações, a intensidade da fluorescência geralmente é proporcional à concentração do fluoróforo.

Ao contrário do que ocorre na espectroscopia UV/visível, não é fácil obter espectros "padrão" independentes do aparelho. Diferentes fatores influenciam e distorcem os espectros, e são necessárias correções para chegar a espectros "verdadeiros", isto é, independentes do equipamento. Essas distorções podem ser classificadas como relacionadas ao instrumento ou à amostra. Entre as distorções instrumentais, a intensidade e as características de comprimento de onda da fonte de luz variam ao longo de cada experimento e entre experimentos. Além disso, nenhuma lâmpada mantém intensidade constante em todos os comprimentos de onda. Para corrigir esse efeito, pode-se instalar um divisor de feixe após o monocromador ou filtro de excitação, desviando parte da luz para um detector de referência.

Também é preciso considerar a eficiência de transmissão dos monocromadores e filtros, que pode mudar ao longo do tempo. A eficiência de transmissão do monocromador varia ainda conforme o comprimento de onda. Por isso, um detector de referência opcional deve ser instalado após o monocromador ou filtro de excitação. A porcentagem da fluorescência captada pelo detector também depende do sistema. A eficiência quântica do detector, isto é, a porcentagem de fótons detectados, varia entre detectores, conforme o comprimento de onda e ao longo do tempo, já que o detector inevitavelmente se deteriora.

Outros dois aspectos a considerar são a óptica usada para direcionar a radiação e o modo de sustentar ou conter o material da amostra, em uma cubeta ou célula. Na maioria das medições no ultravioleta, no visível e no infravermelho próximo, são necessárias cubetas de quartzo de precisão. É preciso escolher materiais com absorção relativamente pequena na faixa de comprimentos de onda de interesse. O quartzo é adequado porque transmite entre 200 e 2.500 nm. Quartzo de maior qualidade pode transmitir até 3.500 nm, enquanto as propriedades de absorção de outros materiais podem mascarar a fluorescência da amostra.

A correção de todos esses fatores instrumentais para obter um espectro "padrão" é trabalhosa e só costuma ser aplicada quando estritamente necessária, como na medição do rendimento quântico ou na determinação do comprimento de onda de maior intensidade de emissão.

As distorções também podem ter origem na amostra. A fotodecomposição pode reduzir a intensidade da fluorescência ao longo do tempo, e o espalhamento da luz também deve ser considerado. Os tipos mais relevantes nesse caso são o espalhamento de Rayleigh e o espalhamento Raman. A luz espalhada por Rayleigh tem o mesmo comprimento de onda da luz incidente, enquanto no espalhamento Raman o comprimento de onda da luz espalhada se altera, geralmente para valores maiores. O espalhamento Raman resulta de um estado eletrônico virtual induzido pela luz de excitação. A partir desse estado virtual, as moléculas podem relaxar para um nível vibracional diferente do estado fundamental vibracional. Nos espectros de fluorescência, esse espalhamento é sempre observado a uma diferença constante de número de onda em relação ao número de onda de excitação. Na água, por exemplo, o pico surge em um número de onda 3.600 cm⁻¹ menor que o da luz de excitação.

Também devem ser considerados os efeitos de filtro interno. Entre eles está a reabsorção. Ela ocorre quando outra molécula, ou parte de uma macromolécula, absorve nos comprimentos de onda em que o fluoróforo emite radiação. Nesse caso, parte ou a totalidade dos fótons emitidos pelo fluoróforo pode ser absorvida novamente. Outro efeito de filtro interno decorre de altas concentrações de moléculas absorventes, inclusive do próprio fluoróforo. A intensidade da luz de excitação, então, não permanece constante em toda a solução. Apenas uma pequena parcela da luz de excitação chega aos fluoróforos visíveis para o sistema de detecção. Os efeitos de filtro interno alteram o espectro e a intensidade da luz emitida e devem ser considerados na análise do espectro de emissão da luz fluorescente.

Fluorescência do triptofano

A fluorescência de uma proteína enovelada é uma mistura da fluorescência de resíduos aromáticos individuais. A maior parte das emissões de fluorescência intrínseca de uma proteína enovelada decorre da excitação de resíduos de triptofano, com parte das emissões proveniente de tirosina e fenilalanina. As pontes dissulfeto também apresentam absorção apreciável nessa faixa de comprimentos de onda. Em geral, o triptofano tem comprimento de onda de absorção máxima de 280 nm e um pico de emissão solvatocrômico entre cerca de 300 e 350 nm, dependendo da polaridade do ambiente local. A fluorescência de proteínas pode, assim, ser usada como indicador do estado conformacional de uma proteína. A fluorescência do triptofano é fortemente influenciada pela proximidade de outros resíduos. Grupos protonados próximos, como Asp ou Glu, podem causar supressão da fluorescência do Trp. Também pode ocorrer transferência de energia entre o triptofano e outros aminoácidos fluorescentes, o que afeta a análise, especialmente quando se emprega a abordagem ácida de Förster. O triptofano é um aminoácido relativamente raro, e muitas proteínas contêm apenas um ou poucos resíduos de triptofano. Sua fluorescência pode fornecer uma medida muito sensível do estado conformacional de resíduos individuais. Em comparação com sondas extrínsecas, a vantagem é que a própria proteína não é alterada. Na prática, o uso da fluorescência intrínseca para estudar a conformação de proteínas fica limitado a casos com poucos resíduos de triptofano, talvez apenas um, pois cada resíduo encontra um ambiente local diferente e produz um espectro de emissão distinto.

O triptofano é um importante fluoróforo intrínseco, um aminoácido que pode ser usado para estimar a natureza de seu microambiente. Em experimentos com desnaturantes, tensoativos ou outras moléculas anfifílicas, o microambiente do triptofano pode mudar. Se, por exemplo, uma proteína com um único triptofano em seu núcleo "hidrofóbico" for desnaturada pelo aumento da temperatura, aparecerá um espectro de emissão deslocado para o vermelho. Isso ocorre porque o triptofano fica exposto a um ambiente aquoso, em vez do interior hidrofóbico da proteína. A adição de um tensoativo a uma proteína cujo triptofano esteja exposto ao solvente aquoso causará um espectro de emissão deslocado para o azul se o triptofano ficar incorporado à vesícula ou micela do tensoativo. Proteínas sem triptofano podem ser acopladas a um fluoróforo.

Com excitação de fluorescência a 295 nm, o espectro de emissão do triptofano predomina sobre a fluorescência mais fraca da tirosina e da fenilalanina.

Proteínas fluorescentes resolvidas no tempo

As proteínas fluorescentes resolvidas no tempo (TRFPs, do inglês time-resolved fluorescent proteins) são biomoléculas derivadas de proteínas fluorescentes naturais, como a proteína verde fluorescente (GFP) de Aequorea victoria. As TRFPs fluorescem por intervalos limitados, de 1 a 10 nanossegundos, que variam conforme fatores ambientais como o pH ou interações moleculares. Seu desenvolvimento começou no início dos anos 2000, e elas ampliam as possibilidades da microscopia de imagem por tempo de vida de fluorescência (FLIM), oferecendo maior contraste que métodos baseados em intensidade ao reduzir a autofluorescência e permitir a multiplexação de sinais.

As TRFPs emitem luz após a excitação, com tempos de vida medidos por contagem de fótons únicos correlacionada no tempo. Variantes como mTFP1, verde-azulada, com cerca de 2,6 ns, e mScarlet-I, vermelha, com cerca de 3,1 ns, apresentam altos rendimentos quânticos e fotoestabilidade, o que as torna adequadas para imageamento de células vivas. Codificadas geneticamente, as TRFPs são introduzidas nas células por plasmídeos e permitem acompanhar de modo não invasivo eventos como enovelamento de proteínas, sinalização iônica ou atividade enzimática.

TRFPs otimizadas por inteligência artificial apresentam tempos de vida mais longos e emissões mais brilhantes, ampliando seu uso em microscopia de super-resolução. Elas são usadas em organismos-modelo como Drosophila e o peixe-zebra. Entre as dificuldades estão o risco de fotobranqueamento, a instrumentação complexa necessária para FLIM e a penetração limitada em tecidos profundos por causa do espalhamento. Variantes com emissão deslocada para o vermelho podem amenizar essa limitação.

Outras pesquisas procuram combinar TRFPs com CRISPR em estudos direcionados de genes.

A integração da técnica em diagnósticos clínicos, como na detecção de microambientes tumorais, exige sistemas FLIM de custo acessível. Pesquisas buscam aumentar o brilho, reduzir a toxicidade e ampliar as faixas espectrais.

Em 2025, pesquisadores criaram 28 novas TRFPs, acrescentando cores e intervalos temporais que ampliaram as opções de uso da técnica. Para isso, modificaram alguns resíduos de aminoácidos a fim de desestabilizar a região que gerava o sinal fluorescente.

Um desafio da espectroscopia de fluorescência é o efeito de filtro interno (IFE), que ocorre em amostras de alta concentração nas quais a própria amostra absorve a luz de excitação ou de emissão, reduzindo artificialmente os sinais de fluorescência e distorcendo os espectros. Para lidar com esse efeito, alguns instrumentos modernos realizam simultaneamente medições de absorbância-transmissão e de matriz de excitação-emissão de fluorescência (A-TEEM). Ao registrar ao mesmo tempo dados de absorbância e fluorescência, o método permite corrigir matematicamente de imediato os efeitos de filtro interno primário e secundário. Essa técnica multimodal é muito usada para impressão digital molecular no monitoramento ambiental, por exemplo no acompanhamento de matéria orgânica dissolvida colorida (CDOM), e na caracterização de matrizes complexas em ciência dos alimentos, reduzindo a necessidade de diluição extensa das amostras.

Aplicações

A espectroscopia de fluorescência é usada, entre outras áreas, em pesquisas bioquímicas, médicas e químicas para analisar compostos orgânicos. Também há relato de seu uso para diferenciar tumores malignos da pele de tumores benignos.

Técnicas de espectroscopia de fluorescência atômica (AFS) são úteis em outros tipos de análise e medição de compostos presentes no ar, na água ou em outros meios. Entre elas está a CVAFS, usada na detecção de metais pesados como o mercúrio.

A fluorescência também pode ser usada para redirecionar fótons, como em um coletor solar fluorescente.

A espectroscopia de fluorescência também pode ser adaptada à escala microscópica por meio da microfluorimetria.

Na química analítica, detectores de fluorescência são usados com HPLC.

Na pesquisa sobre água, a espectroscopia de fluorescência pode ser usada para monitorar a qualidade da água por meio da detecção de poluentes orgânicos. Avanços em ciência da computação e aprendizado de máquina também permitiram detectar contaminação bacteriana da água.

Na pesquisa biomédica, a espectroscopia de fluorescência é usada para avaliar a eficiência da distribuição de fármacos por meio do acoplamento de agentes fluorescentes a diferentes medicamentos.

Na pesquisa biofísica, a espectroscopia de fluorescência permite visualizar e caracterizar domínios lipídicos em membranas celulares.

As TRFPs são usadas na transferência de energia por ressonância de Förster (FRET) para estudar a proximidade molecular e acompanhar alterações metabólicas em doenças como câncer ou neurodegeneração.

Ver também

• Fotoluminescência, emissão de luz após a absorção de radiação eletromagnética
• Fluorescência induzida por laser, técnica em que um laser excita espécies fluorescentes para análise
• Espectroscopia de absorção, técnica complementar baseada na absorção de radiação
• Microscopia de fluorescência, aplicação da fluorescência à formação de imagens microscópicas

Referências

Ligações externas

• Fluorophores.org, banco de dados de corantes fluorescentes
• OpenFluor, ferramentas comunitárias para análise quimiométrica da fluorescência de matéria orgânica
• Banco de dados de minerais fluorescentes com imagens, ativadores e espectros, no Fluomin.org

• Portal da química
• Portal da física