Ilustração dos componentes básicos de um imunoensaio, que inclui um analito (verde), um anticorpo (preto) e um rótulo detectável (amarelo)
Um imunoensaio é um teste bioquímico que mede a presença ou concentração de uma macromolécula ou uma pequena molécula em uma solução através do uso de um anticorpo (usualmente) ou um antígeno (às vezes). A molécula detectada pelo imunoensaio é frequentemente referida como um "analito" e é em muitos casos uma proteína, embora possam ser outros tipos de moléculas, de tamanhos e tipos diferentes, desde que sejam desenvolvidos os anticorpos adequados que tenham as propriedades adequadas para o ensaio. Analitos em líquidos biológicos tais como soro ou urina são frequentemente medidos usando-se imunoensaios para propósitos médicos e de pesquisa.
Os imunoensaios apresentam-se em diversos formatos e variações. Podem ser realizados em várias etapas, com a adição e remoção de reagentes ou a separação dos mesmos em diferentes momentos do ensaio. Os ensaios em várias etapas são frequentemente designados por imunoensaios de separação ou imunoensaios heterogéneos. Alguns imunoensaios podem ser realizados simplesmente misturando os reagentes e as amostras e efetuando uma medição física. Esses ensaios são denominados imunoensaios homogéneos ou, menos frequentemente, imunoensaios sem separação.
A utilização de um calibrador é frequente nos imunoensaios. Os calibradores são soluções que se sabe conterem o analito em questão, sendo a concentração desse analito geralmente conhecida. A comparação da resposta de um ensaio a uma amostra real com a resposta do ensaio produzida pelos calibradores permite interpretar a intensidade do sinal em termos da presença ou concentração do analito na amostra.
Princípio
Os imunoensaios baseiam-se na capacidade de um anticorpo reconhecer e ligar-se a uma macromolécula específica no que pode ser uma mistura complexa de macromoléculas. Na imunologia, a macromolécula específica à qual um anticorpo se liga é designada por «antigénio» e a área do antigénio à qual o anticorpo se liga é denominada «epítopo».
Em alguns casos, um imunoensaio pode utilizar um antigénio para detetar a presença de anticorpos, que reconhecem esse antigénio, numa solução. Por outras palavras, em alguns imunoensaios, o analito pode ser um anticorpo em vez de um antigénio.
Para além da ligação de um anticorpo ao seu antígeno, a outra característica fundamental de todos os imunoensaios é um meio de produzir um sinal mensurável em resposta a essa ligação. A maioria dos imunoensaios, embora não todos, envolve a ligação química de anticorpos ou antígenos a algum tipo de marcador detetável. Existe um grande número de marcadores nos imunoensaios modernos, os quais permitem a deteção através de diferentes meios. Muitos marcadores são detetáveis porque emitem radiação, provocam uma mudança de cor numa solução, apresentam fluorescência sob a luz ou podem ser induzidos a emitir luz.
História
Rosalyn Sussman Yalow e Solomon Berson são reconhecidos como os criadores dos primeiros imunoensaios na década de 1950. Yalow recebeu o Prémio Nobel pelo seu trabalho em imunoensaios em 1977, tornando-se a segunda mulher norte-americana a ganhar o prémio.
Os imunoensaios tornaram-se consideravelmente mais simples de realizar e mais populares quando, no final da década de 1960, foram demonstradas técnicas para ligar quimicamente enzimas a anticorpos.
Em 1983, o professor Anthony Campbell, da Universidade de Cardiff, substituiu o iodo radioativo utilizado no imunoensaio por um éster de acridínio que emite a sua própria luz: a quimioluminescência. Este tipo de imunoensaio é agora utilizado em cerca de 100 milhões de análises clínicas por ano em todo o mundo, permitindo aos médicos medir uma vasta gama de proteínas, agentes patogénicos e outras moléculas em amostras de sangue.
Em 2012, a indústria comercial de imunoensaios faturou 17 mil milhões e estimava-se que tivesse perspetivas de um crescimento anual lento, na ordem dos 2 a 3 por cento.
Marcadores
Os imunoensaios utilizam uma variedade de marcadores diferentes para permitir a deteção de anticorpos e antigénios. Os marcadores são normalmente ligados quimicamente ou conjugados ao anticorpo ou antigénio desejado.
Enzimas
Possivelmente, um dos marcadores mais populares utilizados em imunoensaios são as enzimas. Os imunoensaios que utilizam enzimas são designados por imunoensaios enzimáticos (EIA), sendo os ensaios imunoabsorventes ligados a enzimas (ELISA) e a técnica de imunoensaio multiplicado por enzimas (EMIT) os tipos mais comuns.
As enzimas utilizadas nos ELISA incluem a peroxidase de rábano (HRP), a fosfatase alcalina (AP) ou a glicose oxidase. Estas enzimas permitem a deteção, muitas vezes porque produzem uma alteração de cor observável na presença de determinados reagentes. Em alguns casos, estas enzimas são expostas a reagentes que as levam a produzir luz ou quimioluminescência. Existem vários tipos de ELISA: direto, indireto, tipo «sanduíche» e competitivo.
Isótopos radioativos
Os isótopos radioativos podem ser incorporados em reagentes de imunoensaio para produzir um radioimunoensaio (RIA). A radioatividade emitida pelos complexos anticorpo-antigénio ligados pode ser facilmente detetada utilizando métodos convencionais.
Os RIAs foram alguns dos primeiros imunoensaios desenvolvidos, mas caíram em desuso, em grande parte devido à dificuldade e aos potenciais perigos associados ao trabalho com radioatividade.
Repórteres de ADN
Uma abordagem mais recente aos imunoensaios envolve a combinação da reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (RT-qPCR) com técnicas tradicionais de imunoensaio. Denominada PCR imunoquantitativa em tempo real (iqPCR), a marca utilizada nestes ensaios é uma sonda de ADN.
Outra abordagem que utiliza marcadores de ADN é a plataforma de imunoensaio multiplex NULISA, concebida para detetar proteínas a níveis inferiores a pg/mL (fg/mL). A tecnologia recorre a um mecanismo sequencial de captura e libertação de imunocomplexos, combinado com uma leitura por sequenciação de última geração. De acordo com uma investigação publicada na revista «Nature Communications», a plataforma é capaz de realizar a análise multiplex de um único alvo até centenas de alvos numa única amostra.
Marcadores fluorogênicos
Marcadores fluorogênicos, como a ficoeritrina, são utilizados em vários imunoensaios modernos.
Marcadores eletroquimioluminescentes
Alguns marcadores funcionam por meio da eletroquimioluminescência (ECL), na qual o marcador emite luz detetável em resposta a uma corrente elétrica.
Imunoensaios sem marcadores
Embora geralmente se utilize algum tipo de marcador nos imunoensaios, existem certos tipos de ensaios que não dependem de marcadores, mas que, em vez disso, empregam métodos de deteção que não requerem a modificação ou marcação dos componentes do ensaio. A ressonância plasmónica de superfície é um exemplo de técnica que permite detetar a ligação entre um anticorpo não marcado e os antigénios.
Classificações e formatos
Os imunoensaios podem ser realizados em diversos formatos. Geralmente, um imunoensaio enquadra-se numa de várias categorias, dependendo da forma como é realizado.
Imunoensaios competitivos e homogéneos
Num imunoensaio competitivo e homogéneo, o analito não marcado presente numa amostra compete com o analito marcado pela ligação a um anticorpo. A quantidade de analito marcado e não ligado é então medida. Em teoria, quanto mais analito houver na amostra, mais analito marcado é deslocado e, consequentemente, medido; por isso, a quantidade de analito marcado e não ligado é proporcional à quantidade de analito na amostra.
O ‘’'imunoensaio de polarização de fluorescência (FPIA)‘’' mede o sinal de polarização de fluorescência após a incubação, sem separar os marcadores ligados dos livres. São adicionadas à amostra moléculas análogas do analito marcadas e livres, cujo movimento browniano difere quando ligadas a um anticorpo (Ab) de grande dimensão em comparação com quando estão livres na solução. O analito compete pela ligação ao Ab e, se o analito marcado se ligar ao Ab, é produzido um sinal. A intensidade do sinal é inversamente proporcional à concentração do analito.
Na ‘’'técnica de imunoensaio multiplicado por enzima (EMIT)‘’', as moléculas livres de análogo do analito marcadas com uma enzima (por exemplo, a enzima glicose-6-fosfato desidrogenase) competem com o analito a ser testado. A enzima ativa reduz o NAD (sem sinal) a NADH (que absorve a 340 nm), pelo que a absorvância é monitorizada a 340 nm. Quando o analito marcado se liga ao anticorpo, a enzima torna-se inativa e é gerado um sinal pelo marcador livre. A intensidade do sinal é diretamente proporcional à concentração do analito.
O ‘’'imunoensaio luminescente de canalização de oxigénio (LOCI)‘’' gera espécies de oxigénio singlete em microesferas acopladas ao analito e, quando o analito se liga à respetiva molécula de anticorpo, acoplada a outro tipo de esfera, o analito reage com o oxigénio singlete, gerando sinais de quimioluminescência proporcionais à concentração do complexo analito-anticorpo.
Na ‘’'interação cinética de micropartículas em solução (KIMS)‘’' e no ‘’'imunoensaio de inibição turbidimétrica potenciada por partículas (PETINIA)‘’', os anticorpos livres ligam-se a conjugados de micropartículas de fármaco para formar agregados que absorvem na gama do visível na ausência do analito. Na presença do analito, o anticorpo liga-se ao analito livre, impedindo a agregação das micropartículas e provocando uma redução na absorvância. O sinal é inversamente proporcional à concentração do analito.
O ‘’'imunoensaio com doador enzimático clonado (CEDIA)‘’' envolve a modificação genética de uma enzima (por exemplo, beta-galactosidase) em dois fragmentos inativos: um pequeno doador enzimático (ED) conjugado com o análogo do fármaco e um aceitador enzimático maior (EA). Quando os dois fragmentos se associam, a enzima completa converte um substrato num produto colorido resultante da clivagem. Se estiverem presentes moléculas do analito farmacológico, estas competem com o fármaco marcado com ED em solução pelos locais limitados do anticorpo. O análogo do fármaco marcado com ED, na forma livre, ligar-se-á ao EA, gerando um sinal colorimétrico diretamente proporcional à quantidade de analito.
Imunoensaios competitivos e heterogéneos
Tal como num imunoensaio competitivo e homogéneo, o analito não marcado numa amostra compete com o analito marcado pela ligação a um anticorpo. Nos ensaios heterogéneos, o analito marcado e não ligado é separado ou removido por lavagem, e o analito marcado e ligado remanescente é medido.
Imunoensaios não competitivos de um único sítio
Ao misturar uma amostra com anticorpos marcados, o analito alvo liga-se aos anticorpos marcados. Os anticorpos marcados não ligados são removidos por lavagem e os anticorpos marcados ligados são medidos. A intensidade do sinal é diretamente proporcional à quantidade de analito na amostra.
Imunoensaios não competitivos de dois sítios
O analito na amostra desconhecida liga-se ao sítio do anticorpo; em seguida, o anticorpo marcado liga-se ao analito. A quantidade de anticorpo marcado presente no sítio é então medida. Esta será diretamente proporcional à concentração do analito, uma vez que o anticorpo marcado não se ligará se o analito não estiver presente na amostra desconhecida. Este tipo de imunoensaio é também conhecido como ensaio «sanduíche», uma vez que o analito fica «encaixado» entre dois anticorpos.
Exemplos
Exames clínicos
Uma vasta gama de exames médicos são imunoensaios, denominados «imunodiagnósticos» neste contexto. Muitos testes de gravidez caseiros são imunoensaios, que detetam o marcador de gravidez gonadotrofina coriônica humana (hCG). Mais especificamente, são testes qualitativos que detetam a presença de hCG, utilizando um sistema de fluxo lateral. O teste rápido de antigénio para a COVID-19 é também um teste qualitativo de fluxo lateral.
Outros imunoensaios clínicos são quantitativos; medem quantidades. Os imunoensaios podem medir os níveis de CK-MB para avaliar doenças cardíacas, de insulina para avaliar a hipoglicemia, do antigénio específico da próstata para detetar o cancro da próstata, e alguns são também utilizados para a deteção e/ou medição quantitativa de alguns compostos farmacêuticos (ver técnica de imunoensaio multiplicado por enzimas para mais detalhes).
Os testes de deteção de drogas também começam com um imunoensaio qualitativo rápido.
Análise antidoping no desporto
Os imunoensaios são utilizados em laboratórios antidoping desportivos para analisar amostras de sangue de atletas, com vista a detetar a presença do hormónio de crescimento humano recombinante (rhGH, rGH, hGH, GH), que é proibido.
Investigação
Imunoensaio fotoacústico
O imunoensaio fotoacústico mede sinais acústicos de baixa frequência gerados por marcadores de nanopartículas metálicas. Iluminadas por uma luz modulada num comprimento de onda de ressonância plasmónica, as nanopartículas geram um sinal acústico forte, que pode ser medido utilizando um microfone. O imunoensaio fotoacústico pode ser aplicado a testes de fluxo lateral, que utilizam nanopartículas coloidais.
Bibliografia
Berson S. A., Yalow R. S., Bauman A., Rothschild M. A. and Newerly K., Insulin-I131 metabolism in human subjects: demonstration of insulin binding globulin in the circulation of insulin treated subjects, Journal of Clinical Investigation, vol. 35, no. 2, 170-190 (1956)
Yalow R. S. and Berson S. A., Immunoassay of endogenous plasma insulin in man, Journal of Clinical Investigation, vol. 39, no. 7,1157-1175 (1960)
Yalow R. S. and Berson S. A., Immunoassay of plasma insulin in man, Diabetes, vol. 10, no. 5, 339-344 (1961)
Wide L. and Porath J., Radioimmunoassay of proteins with the use of Sephadex-coupled antibodies, Biochimica et Biophysica Acta - General Subjects, vol. 130, no. 1, 257-260 (1966)
Nakane P. K. and Pierce G. B. Jr., Enzyme-labeled antibodies for the light and electron microscopic localization of tissue antigens, Journal of Cell Biology, vol. 33, no. 2, 307-318 (1967)
Avrameas S., Coupling of enzymes to proteins with glutaraldehyde. Use of the conjugates for the detection of antigens and antibodies, Immunochemistry, vol. 6, no. 1, 43-52 (1969)
Engvall E. and Perlmann P., Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Quantitative assay of immunoglobulin G, Immunochemistry, vol. 8, no. 9, 871-874 (1971)
van Weemen B. K. and Schuurs A. H. W. M., Immunoassay using antigen-enzyme conjugates, FEBS letters, vol. 15, no. 3, 232-236 (1971)
van Weemen B. K. and Schuurs A. H. W. M., Immunoassay using hapten-enzyme conjugates, FEBS letters, vol. 24, no. 1, 77-81 (1972)
Pittman J. A. Jr., RIA: An historical note, Clinical Chemistry, vol. 19, no. 7, 793 (1973)
van Weemen B. K. and Schuurs A. H. W. M,, Immunoassay using antibody-enzyme conjugates, FEBS letters, vol. 43, no. 2, 215-218 (1974)
Voller A., Bidwell D. E. and Engvall E., A microplate method of enzyme-linked immunosorbent assay and its application to malaria, Bulletin of the World Health Organization, vol. 51, no. 2, 209-211 (1974)
Voller A., Bidwell D. E. and Bartlett A., Enzyme immunoassays in diagnostic medicine, Bulletin of the World Health Organization, vol. 53, no. 1, 55-65 (1976)
Yalow R. S., Citation Classic, Current Contents, 14, 98 (1977)
Yalow R. S., Radioimmunoassay: a probe for the fine structure of biologic systems, Science, vol. 200, no. 4347, 1236-1245 (1978)
Engvall E., Citation Classic, Current Contents, 12, 16 (1987)
Voller A. and Bidwell D. E., Better health care with microplate ELISA, Citation Classic, Current Contents, 17, 14 (1989)
Mujumdar R. B., Ernst L. A., Mujumdar S. R. and Waggoner A. S., Cyanine dye labeling reagents containing isothiocyanate groups, Cytometry, vol. 10, no. 1, 11-19 (1989)
Yalow R. S., Remembrance project: origins of RIA, Endocrinology, vol. 129, no. 4, 1694-1695 (1991)
Engvall E., Perspective on the historical note on EIA/ELISA by Dr. R. M. Lequin, Clinical Chemistry, vol. 51, no. 12, 2225 (2005)
van Weemen B. K., The rise of EIA/ELISA, Clinical Chemistry, vol. 51, no. 12, 2226 (2005)
Lequin R. M., Enzyme Immunoassay (EIA)/Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA), Clinical Chemistry, vol. 51, no. 12, 2415-2418 (2005)
Avrameas S., Historical background of the invention of EIA and ELISA, Clinical Chemistry, vol. 52, no. 7, 1430-1431 (2006)
Hammarström S., Berzins K., Biberfeld P., Engvall E., Hammarström M.-L., Holm G., Troye-Blomberg M. and Wahlgren M., Peter Perlmann 1919-2005, Scandinavian Journal of Immunology, vol. 63, no. 6, 487-489 (2006)
