Antivirusprogrammen fungerar i första hand genom att jämföra de filer som skall kontrolleras med en lista på "fingeravtryck", så att programmet känner igen sedan förut kända virus och varianter på dessa. När ny, tillräckligt annorlunda, skadlig kod konstruerats måste någon upptäcka denna och skicka den till dem som upprätthåller antivirusprogrammen, varefter koden analyseras och uppdaterade definitionsfiler distribueras. Det är alltså väsentligt för användare av antivirusprogramvara att regelbundet uppdatera de lokala definitionsfilerna, gärna automatiskt.
I viss mån studerar antivirusprogrammen också misstänkta programfilers funktion, genom att analysera programkoden eller köra den i en "sandlåda", för att hitta otillåtna eller för viruskod typiska funktioner, såsom försök att modifiera andra program. Också många legitima program fungerar på sätt som påminner om virusen, varför nyttan av denna analys är begränsad. Det finns också en risk att antivirusprogrammet tar bort legitima filer som det felaktigt tror är skadlig programkod.
Den som tillverkar ny skadlig kod kan lätt testa den på de vanligaste antivirusprogrammen och därmed försäkra att koden inte upptäcks genast. Därför ger antivirusprogram inte något väsentligt skydd mot sakkunnigt genomförda riktade attacker. Däremot kan ett antivirusprogram vara ett extra skydd mot skadlig programkod för den vardagliga användaren så länge antivirusprogrammets datorvirus-uppdateringar görs regelbundet.
