Sitio AP

Representación esquemática de un sitio AP en el ADN.

En bioquímica y genética molecular, un sitio AP (sitio apurínico o apirimidínico), también conocido como sitio abásico, es una posición en una molécula de ADN (y, mucho más raramente, en el ARN) que carece de una base nitrogenada purina o pirimidina. Su origen puede ser espontáneo o derivar del daño en el ADN. Se estima que, en condiciones fisiológicas, se generan diariamente en una célula unos 10 000 sitios apurínicos y 500 apirimidínicos.

Los sitios AP pueden formarse por depurinación espontánea, pero también surgen como intermediarios en la vía de reparación por escisión de bases. En este proceso, una ADN glicosilasa reconoce una base dañada y escinde el enlace N-glucosídico para liberar la base, generando así un sitio AP. Existen diversas glicosilasas especializadas en diferentes tipos de daño, como bases oxidadas, metiladas o la incorporación de uracilo en el ADN. El sitio AP puede ser escindido por una endonucleasa AP, que deja extremos 3' hidroxilo y 5' desoxirribosfosfato. Alternativamente, las glicosilasas-liasa bifuncionales pueden escindir el sitio AP, dejando un fosfato 5' adyacente a un aldehído 3' α,β-insaturado. Ambos mecanismos generan una rotura de una sola hebra, que posteriormente es reparada mediante reparación por escisión de bases de parche corto o parche largo.

Si no se reparan, los sitios AP pueden provocar mutaciones durante la replicación semiconservativa del ADN. Pueden causar el estancamiento de la horquilla de replicación y son superados por mecanismos de síntesis translesión. En Escherichia coli, se inserta preferentemente una adenina frente al sitio AP (regla "A"). En eucariontes superiores, la situación es más compleja, y la preferencia por un nucleótido u otro varía según el organismo y las condiciones experimentales.

Formación

Los sitios AP se forman cuando la desoxirribosa se escinde de su base nitrogenada mediante la ruptura del enlace glucosídico. Esto puede ocurrir espontáneamente, como resultado de actividad química, radiación o por acción enzimática. Los enlaces glucosídicos en el ADN pueden romperse por hidrólisis catalizada por ácidos. Las purinas pueden eliminarse en condiciones débilmente ácidas, mientras que las pirimidinas requieren una acidez más fuerte. Incluso a pH neutro, las purinas pueden perderse si la temperatura es suficientemente alta. La formación de sitios AP también puede ser inducida por diversos agentes químicos modificadores de bases. La alquilación, la desaminación y la oxidación de bases individuales pueden debilitar el enlace glicosídico, favoreciendo su ruptura.

La radiación ionizante también puede generar sitios AP. Los radicales libres producidos en entornos irradiados pueden atacar los enlaces glucosídicos, creando directamente un sitio AP, o pueden unirse a la base o al anillo de desoxirribosa, desestabilizando el enlace.

Las enzimas, particularmente las ADN glicosilasas, crean sitios AP como parte de la vía de reparación por escisión de bases. En una célula de mamífero típica, se estima que se forman entre 5000 y 10 000 sitios apurínicos por día. Los sitios apirimidínicos se generan a una velocidad aproximadamente 20 veces menor, con unos 500 eventos diarios por célula. Dadas estas elevadas tasas, es crucial que las células dispongan de un sistema de reparación eficiente para prevenir mutaciones.

Características

Propiedades químicas

Los sitios AP son extremadamente reactivos. Pueden existir en equilibrio entre una forma de anillo de furanosa y una forma de cadena abierta con un grupo aldehído y un alcohol libre. La exposición a un nucleófilo puede desencadenar una reacción de eliminación β, que rompe el enlace fosfodiéster 3', generando una rotura de una sola hebra. Esta reacción puede ser catalizada por una AP liasa. En presencia de un exceso de reactivo, puede ocurrir una eliminación adicional en el lado 5'. El aldehído libre también puede reaccionar con aminas nucleofílicas. Estas reacciones pueden promover aún más la escisión del enlace fosfoéster. Por el contrario, compuestos que contienen grupos O-NH2 pueden reaccionar con el grupo aldehído estabilizando el sitio abásico sin romper el enlace fosfodiéster.

Mecanismo de reacción de una AP liasa. Adaptado de Gates (2009).

Actividad biológica

Los sitios AP en células vivas pueden tener graves consecuencias, incluyendo la muerte celular. Las roturas de una sola hebra derivadas de la eliminación β requieren reparación por ADN ligasa para evitar mutaciones. Cuando una ADN polimerasa se encuentra con un sitio abásico, la replicación del ADN suele bloquearse, lo que puede conducir a roturas de una o ambas hebras. En E. coli, cuando la polimerasa logra sortear el sitio abásico, se incorpora preferentemente una adenina en la nueva cadena. Si los sitios AP no se reparan, la replicación no puede proceder con normalidad y pueden producirse mutaciones significativas. Si las mutaciones son simplemente polimorfismos de un solo nucleótido, la célula podría no verse afectada. Sin embargo, mutaciones más graves pueden alterar la función celular, afectar el crecimiento y la división, o provocar la muerte de la célula.

Reparación

Los sitios AP son intermediarios clave en la vía de reparación por escisión de bases. Las ADN glicosilasas crean primero los sitios abásicos al reconocer y eliminar bases modificadas. Existen múltiples variantes de glicosilasas para hacer frente a los diferentes tipos de daño en las bases (alquilación, oxidación, presencia de uracilo, etc.). Una vez generado el sitio AP, una endonucleasa AP cataliza la ruptura de un enlace fosfodiéster, creando una muesca en el esqueleto de la hélice. La ruptura puede ocurrir 3' o 5' del sitio, según la variante enzimática. Las enzimas de procesamiento de extremos preparan entonces la muesca para la acción de la ADN polimerasa, que inserta el nucleótido complementario a la base de la hebra opuesta. Finalmente, la ADN ligasa sella la muesca.

Referencias

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