Levaansukraas

Levaansukraasid (ehk sahharoos:2,6-fruktaan 6-D-fruktosüültransferaas; EC 2.4.1.10) on bakteriaalsed ekstratsellulaarsed (rakuvälised) ensüümid. Nad viivad läbi nii sahharoosi hüdrolüüsi kui ka fruktoosijäägi ülekannet (transfruktosüleerimist), mille käigus võivad moodustuda väga pikad polüfruktoosid ehk fruktaanid (levaansukraasi puhul levaanid). Selle järgi on nimetatud ka ensüüm: levaan on tekkinud saadus ning lõpp "-sukraas" viitab sahharoosi hüdrolüüsile.

Levaansukraasid koos beetafruktofuranosidaaside ja inulosukraasidega kuuluvad glükosiidi hüdrolaaside 68. sugukonda (CAZy andmebaasi järgi GH68). Levaansukraasid koos teiste selle sugukonna ensüümidega eelistavad substraadina kasutada sahharoosi. Levaansukraas on võimeline moodustama nii lühikesi fruktooligosahhariide (FOS) kui ka väga pikki levaan-tüüpi fruktaane.

Erinevalt taimedest vajavad bakterid erineva pikkusega fruktaanide biosünteesiks – substraadi hüdrolüüsiks ning fruktoosijääkide polümeriseerimiseks – ainult üht ensüümi. Levaansukraasid sünteesivad lahustuvaid kõrge polümerisatsiooniastmega levaane, mille mass ulatub 20 kilodaltonist mitme megadaltonini. Levaansukraasid on enim uuritud bakteriaalsed fruktosüültransferaasid. Levaansukraasi geene leidub nii grampositiivsetes kui ka gramnegatiivsetes bakterites, kuid inulosukraase on leitud ainult grampositiivsetest piimhappebakteritest.

Levaansukraase on leitud paljude bakteriperekondade esindajatelt: batsillid, laktobatsillid, pseudomonaadid, streptokokid jt.

Erinevate bakterite levaansukraasid töötavad erinevalt. Erineb afiinsus sahharoosi suhtes ja reaktsioonikiirus. Samuti varieerub suuresti ka produktide pikkus. Ensüümi odavaks tooraineks võib kasutada suhkrupeedi siirupit ja melassi, mis sisaldavad palju sahharoosi.

Levaansukraasi sünteesiproduktidel on mitmeid rakendusi (vt Levaan).

Reaktsioon ja produktid

Ensüüm katalüüsib järgnevat reaktsiooni: substraat + aktseptor -> glükoos + fruktosüül-aktseptor

Sahharoos võib olla nii doonor kui ka aktseptor.

Moodustunud 6-kestoosist võib saada järgmine aktseptor, kuhu fruktoosijääk liidetakse. Nii jätkates võib ulatuda liidetud fruktoosijääkide arv üle 100 000. Kujutatud reaktsioon on üks võimalikest: moodustuda võib veel neokestoos või 1-kestoos

Bakteriaalsed fruktaansukraasid sh levaansukraasid katkestavad substraadi glükosiidsideme, milleks on tavaliselt sahharoos, kuid võib olla ka rafinoos või stahhüoos.

Vabanenud energiat kasutatakse fruktosüüli liitmiseks kasvavale fruktaani ahelale (levaanile), sahharoosile, veele (hüdrolüüs) või mõnele teisele aktseptorile. Kuna pärast glükosiidsideme hüdrolüüsi jääb fruktoosijääk ensüümiga seotuks ja esimeseks aktseptoriks levaani moodustumisel on teine sahharoosi molekul, siis jääb iga ahela otsa üks glükoosijääk. Enamik levaansukraase järgivad Michaelis-Menteni kineetikat hüdrolüüsi ja transferaasi reaktsioonide kohta. Teadaolevateks eranditeks on Lactobacillus reuter’i ja Lactobacillus sanfrancisensis’e levaansukraas, mida sahharoos ei küllasta.

Hargnemine

Levaan võib olla hargnenud ahelatega. Peaahel koosneb β-(2->6)-sidemetest fruktoosi jääkide vahel ning kõrvalahelad on peaahelaga seotud β-(2->1)-sidemete kaudu (sarnasus inuliiniga, mille peaahel koosneb β-(2->1)-sidemetest).

Fruktooligosahhariidide süntees

Kõik bakteriaalsed fruktolüültransferaasid kannavad sahharoosilt fruktoosijääke lisaks fruktaanidele veel mitmetele teistele aktseptormolekulidele. Selliste aktseptoritena võib kasutada vett (sahharoosi hüdrolüüs), sahharoosi või rafinoosi (tulemuseks vastavalt trisahhariid kestoos ja tetrasahhariid nüstoos), lühikese ahelaga atsüülalkoholide, erinevad mono- kuni tetrasahhariidide ja sorbitooli.

Produkti pikkus

Arvatakse, et sünteesitud fruktaani molekulmass sõltub mikroobi kasvu ja inkubatsioonitingimustest, näiteks temperatuurist, soolsusest ja sahharoosi kontsentratsioonidest ning levaansukraasi reaktsioonitingimustest. Näiteks Bacillus subtilis’e levaansukraas hüdrolüüsib madalamatel kontsentratsioonidel sahharoosi glükoosiks ja fruktoosiks, kõrgematel kontsentratsioonidel sünteesitakse levaani ja FOS-e. FOS-ide süntees omakorda toimub kõrgemal substraadi kontsentratsioonil kui levaani süntees. Oluline on ka temperatuur. Näiteks P. syringae patovar (patogeenne alamliik) phaseolicola puhul on märgitud, et suurim levaani produktsioon toimub 18 °C juures ning suurimat hüdrolüüsiaktiivsust täheldati 60 °C juures. Sellest kõrgemal temperatuuril hakkas ensüüm juba stabiilsust kaotama.

Struktuur

Levaansukraasid on viielabalise β-propeller kujuga, mille katalüütilises regioonis on 3 konserveerunud happelist aminohapet (kaks aspartaati ja üks glutamaat).

Levaansukraasid on ehituselt sarnased. Klassikalise "W" kujulise (N- ja C-terminused paiknevad lähestikku) β-propelleri struktuuri moodustavad viis β-lehte (I-V). β-lehed on pakitud vastamisi ning moodustavad iseloomuliku propellerilabasarnase pöörde. Reaktsioonid toimuvad propelleri keskel.

Aminohappelise järjestuste järgi on grampositiivsete ja gramnegatiivsete bakterite levaansukraasid üsna erinevad (identsus ~20%). Piimhappebakterite vastavad ensüümid on suuremad kui teiste bakterite omad. Näiteks S. salivarius’e tüve ATCC 13419 levaansukraas on 140kDa, Z.mobilis’el on see vaid 55 kDa. Enim on uuritud piimhappebakterite fruktaansukraase. Nende ensüümide struktuur on jagatud neljaks osaks: signaalpeptiid; N-terminaalne lõik, mis varieerub pikkuse poolest; konserveerunud umbes ~500 aminohappe pikkune katalüütiline tuum ja C terminaalne varieeruv piirkond, millega mõned ensüümid on seotud rakuseinaga.

Signaalpeptiid ja varieeruv N-terminaalne ala

Grampositiivsete bakterite levaansukraaside N-terminuses on signaalpeptiid, mis suunab nad sekretsioonile. Gramnegatiivsetel see järjestus puudub.

Katalüütiline ala

Aktiivsait asub sügaval negatiivselt laetud taskus. Tsentraaltasku koosneb põhiliselt kõrgeltkonserveerunud järjestuste motiividest. Katalüütilisse kolmikusse kuuluvad Asp (nukleofiil, fruktoosiga esmane seonduja), teine Asp (vaheühendi stabiliseerija) ja Glu (alus-hape katalüüsija). Korraga siseneb taskusse üks substraadi molekul. Sideme katkestamine substraadis (näiteks sahharoosis) toimub −1 ja +1 alampiirkonna vahel. Reaktsioon toimub kahe etapina. Ensüüm seondub kovalentselt substraadi sideme katkestamisele järele jäänud fruktoosijäägiga, moodustades ensüüm-fruktosüül vaheühendi. Järgnevalt seondub aktiivtsentrisse aktseptormolekul (näiteks levaan) ja fruktosüül kantakse aktseptorile. Fruktooside liitmine aktseptormolekulile toimub ükshaaval – enne iga ahela pikendamist on vajalik produkti vabanemine ja uue substraadimolekuli hüdrolüüs. Alapiirkond +1 varieerub perekonna GH68 esindajate hulgas. Need erinevused on selgelt näha grampositiivsete ja gramnegatiivsete bakterite levaansukraaside vahel.

C-terminaalne regioon

C-terminaalne ala võib mõjutada produkti suurust ja/või ensüümi spetsiifikat. Näiteks B. subtilis’e C-terminaalse osa suurendamine põhjustas levaanide suurenenud molekulmassi. Selle suurenemine tulenes põhiliselt rohkemate hargnemiste arvelt (vt Hargnemine). Bakterites, kus levaansukraas kinnitub rakuseinale, on C-terminaalse otsa järjestus oluline levaani ankurdamiseks. L. reuteri’l leidub nii levaansukraasi kui ka inulosukraasi C-terminuses LPXTG motiiv, millesarnane motiiv on ka S. salivarius’e levaansukraasis.

Kaltsiumi seondumine

B. subtilis’e levaansukraasi 3D-struktuuri uurimisel selgus, et ensüümiga võib seondub metalliioon – Ca2+. GH68 perekonna levaansukraaside järjestuste joondamine viitas sellele, et kaltsiumiga seondumisel olulised aminohappejäägid on konserveerunud grampositiivsete bakterite fruktosüültransferaasides.

Levaansukraasi roll bakterite elus

Sahharoosi sisaldaval söötmel moodustunud limane levaan, kui söötmele olid külvatud levaansukraasi ekspresseerivad E. coli transformandid

Gluconacetobacter diazotrophicus

Gluconacetobacter diazotrophicus’el (levaansukraas LsdA) on täheldatud kõrgemat NaCl taluvust, kõrgenenud kuivataluvust ning võimet paremini agregeeruda abiootilistel pindadel, kui bakter toodab levaani. Neid nähtusi selgitab asjaolu, et levaan on kleepuv-limajas ning moodustab bakteri ümber kaitsva kihi.

Pseudomonas syringae

Pseudomonas syringae (levaansukraas Lsc) puhul arvatakse, et levaan võib olla varuaineks. Sellele viitavad levaani vaid kaudne osalus biokile moodustumisel ning levaansukraasi geeniekspressioon toimub bakterite kasvu varajasemas etapis. Kuna levaansukraas on väga stabiiline ekstratsellulaarne ensüüm võib see vaba sahharoosi olemasolu korral koguda toitaineterikkaid makromolekule biokile rakuvabades piirkondades. P. syringae biokile moodustumisel ei olnud levaan vajalik. Moodustunud kapsel tekitab osmootse gradiendi, millega tõmmatakse toitaineid enda poole. On näidatud, et levaan kaitseb pseudomonaade kuivamise ja bakteriofaagide eest.

Erwinia amylovora

Taimepatogeen Erwinia amylovora (levaansukraas Lsc) põhjustab erinevatel taimedel, näiteks õunapuudel, pirnidel ja teistel roosiõieliste (Rosaceae) sugukonna esindajatel viljapuu-bakterpõletikku. Taimed surevad veevoo blokeerimise tõttu. Bakterpõletikule on iseloomulik ka lima, mis koosneb bakteritest, taimemahlast ja eksopolüsahhariididest. On näidatud, et selle bakteri levaansukraasi süntees on mõjutatud hulgatunnetusest (kvoorumtunnetusest). Sellele viitab kindla kasvutiheduse ületades suurenenud levaansukraasi ja seega suurenenud levaani produktsioon. Levaani toodeti põhiliselt eksponentsiaalse kasvu faasis.

Sarnaselt P. syringae’ga ei ole E. amylovora’l levaan biokile moodustumiseks vajalik, kuid aitab selle moodustumisele kaasa. Levaansukraasi kasutatakse sahharoosist glükoosi vabastamiseks ning sünteesitud levaan võib olla peremeesorganismi kaitsemehhanismide vastu. Levaan kaitseb E. amylovora’t ka Cu2+ ioonide eest, moodustades sellega komplekse.

Bacillus subtilis

Bacillus subtilis’e levaansukraas (SacB) on üks enim uuritud fruktosüültransferaase. See oli esimene omataoliste seas, millele määrati 3D-struktuur, steriokeemia ja katalüütiline nukleofiil. B. subtilise levaansukraasi sekreteeritakse SecA raja kaudu. Sellele viitab asjaolu, et SecA suurema hulgaga kasvas rakuvälise levaansukraasi kontsentratsioon. Nagu ka paljudel teistel levaani moodustavatel bakteritel on ka B. subtilise’l levaani lagundav levanaas (SacC). Vabanenud fruktoosi saab bakter kasutada energia tootmiseks.

Viited

  1. 1 2 Yanase H, Maeda M, Hagiwara E, Yagi H, Taniguchi K, Okamoto K (2002). "Identification of Functionally Important Amino Acid Residues in Zymomonas mobilis Levansucrase". J. Biochem. 132, 565–572
  2. ↑ CAZy, CAZy andmebaas (inglise keeles).
  3. 1 2 3 CAZypedia glükosiidi hüdrolaaside 68. perekond (inglise keeles).
  4. 1 2 3 Lammens W, Le Roy K, Schroeven L, Van Laere A, Rabijns A, Wim Van den Ende (2009). "Structural insights into glycoside hydrolase family 32 and 68 enzymes: functional implications". Journal of Experimental Botany, Vol. 60, No. 3, pp. 727–740
  5. ↑ (inglise keeles).
  6. ↑ Ghazi I, Fernandez-Arrojo L, Gomez De Segura A, Alcalde M, Plou F, Ballesteros A (2006). "Beet sugar syrup and molasses as low-cost feedstock for enzymatic production of FOS" J. Agric. Food Chem. 54 ,2964–2968
  7. 1 2 3 4 5 6 7 van Hijum, S. A. F. T., Kralj S, Ozimek L. K, Dijkhuizen L, van Geel-Schutten I G. H. (2006). Microbiology and Molecular Biology Reviews, märts, 157–176 lk
  8. 1 2 Visnapuu T, Mardo K, Mosoarcab C, Zamfir A, Vigants A, Alamäe T (2011). "Levansucrases from Pseudomonas syringae pv. tomato and P. chlororaphis subsp. aurantiaca: Substrate specificity, polymerizing properties and usage of different acceptors for fructosylation". Journal of Biotechnology 155 (2011) 338 – 349
  9. ↑ Hettwer U, Gross M, Rudolph K (1995) "Purification and Characterization of an Extracellular Levansucrase from Pseudomonas syringae pv. phaseolicola". Journal of Bacteriology mai 1995, 2834–2839 lk
  10. ↑ Meng G, Fütterer K (2003). "Structural framework of fructosyl transfer in Bacillus subtilis levansucrase". Nat Struct Biol. 2003 Nov;10(11):935-41. Epub 2003 Sep 28.
  11. ↑ Sangiliyandi G, Raj K C, Gunasekaran P (1999). "Elevated temperature and chemical modification selectively abolishes levan forming activity of levansucrase of Zymomonas mobilis". Biotechnology Letters 21:179–182, 1999
  12. ↑ Velazquez-Hernandez M L, Baizabal-Aguirre V M, Cruz-Vazquez F, Trejo-Contreras M J, Fuentes-Ramirez L E, Bravo-Patino A, Cajero-Juarez M, Chavez-Moctezuma M P, Valdez-Alarcon J J (2010). "G. diazotrophicus levansucrase is involved in biofilm formation". Arch Microbiol. 2011 Feb; 193(2):137-49. Epub 2010 Nov 20.
  13. ↑ Laue H, Schenk A, Li H, Lambertsen L, Neu T R, Molin S, Ullrich M S (2006). "Contribution of alginate and levan formation to biofilm by P. syringae". Microbiology, 152, 2909–2918
  14. ↑ Paton AM (1960) "The role of Pseudomonas in plant disease". J Appl Bacteriol 23: 526–532
  15. ↑ Molina L, Rezzonico F, De´fago G, Duffy B (2005) "Autoinduction in Erwinia amylovora: Evidence of an Acyl-Homoserine Lactone Signal in the Fire Blight Pathogen". Journal of Bacteriology, 3206–3213
  16. 1 2 Oh C, Beer S V (2005). "Molecular genetics of Erwinia amylovora involved in the development of fire blight". FEMS Microbiology Letters, 253 (2005); 185–192
  17. ↑ Koczan J M,Grath M J, Zhao Y, Sundin G W (2009). "Contribution of Erwinia amylovora Exopolysaccharides Amylovoran and Levan to Biofilm Formation: Implications in Pathogenicity" Phytopathology. 2009 Nov; 99(11):1237–44.
  18. ↑ Ordax M, Marco-Noales E, López MM, Biosca EG (2010) "Exopolysaccharides favor the survival of Erwinia amylovora under copper stress through different strategies". Res Microbiol. 2010 Sep; 161(7):549-55. Epub 2010 Jun 3.
  19. ↑ Leloup L, Driessen AJ, Freudl R, Chambert R & Petit-Glatron MF (1999). "Differential dependence of levansucrase and alpha-amylase secretion on SecA (Div) during the exponential phase". J Bacteriol. 1999 Mar; 181(6):1820-6
  20. ↑ Marvasi M, Visscher PT, Casillas Martinez L (2010). "Exopolymeric substances (EPS) from Bacillus subtilis: polymers and genes encoding their synthesis". FEMS Microbiol Lett. 2010 Dec; 313(1):1–9. doi: 10.1111/j.1574-6968.2010.02085.x.