Longueurs d'onde d'excitation de: (1) SYBR green I seul, (2) tous rapports de complexes SYBR green I/ADN double brin, (3 et 4) complexe SYBR green I/ADN simple brin dans un rapport de 1 (3) ou de 10 (4)
Le SYBR green I est une molécule pouvant se fixer sur tous les types d’acides nucléiques double brin. Ce n'est pas un agent intercalant: par définition, un agent intercalant est une molécule pouvant s'insérer entre les plateaux formés par les bases appariées d'un acide nucléique; le SYBR green ne répond pas à cette définition puisqu'il se lie au petit sillon de l'ADN.
Une fois fixé, il devient un très bon fluorophore. Ainsi, le complexe ADN double brin/SYBR green I absorbe la lumière bleue (λmax = 497 nm) et émet de la lumière verte (λmax = 520 nm). L'agent peut également se lier préférentiellement à de l'ADN double brin mais peut également se lier à de l'ADN simple brin avec des performances moindres et des longueurs d'onde d'excitation et d'émission légèrement différentes.
Utilisation
Compte tenu de ces propriétés et de sa toxicité moindre, il a très rapidement servi de méthode alternative au bromure d'éthidium (BET) ou au marquage radioactif pour un grand nombre de méthodes, dont la détection d’ADN et d’ARN sur gels de polyacrylamide ou d’agarose, classique, en champ pulsé ou «sensible», pré- ou post-marqué. Il permet également de quantifier les acides nucléiques en solution et, n’interférant que peu avec la réaction en chaîne par polymérase, il est le principal marqueur séquence aspécifique utilisé en PCR en temps réel. Sa très grande sensibilité le rend exploitable en électrophorèse capillaire (détection jusqu’à 80 femtogrammes d’ADN double brin), en cytométrie de flux, pour des puces à ADN, pour de l’imagerie en fluorescence. Il sert également à la quantification d’activités enzymatiques (DNases, télomérases) ou pour celles de l’ADN double brin en milieu défavorable (par la présence d’inhibiteur de fluorescence).
Historique
Par souci de clarté, les dates correspondent à la première publication sur le domaine et seuls les premiers auteurs sont cités, les références complètes étant dans le chapitre Bibliographie.
1975: Invention d’un test de détection des agents mutagènes et carcinogènes par Ames BN (révisé dans une étude de 1983).
1992: Première publication sur les marqueurs fluorescents de l’ADN de la famille des cyanines asymétriques par Rye HS.
1993: Première mention du SYBR green I par Molecular Probes dans le Bioprobes no18 (numéro en ligne jusqu’au 23, à vérifier).
1994: Premières études de caractérisation du SYBR green I par Jin X.
1994: Premier marquage d’ADN et d’ARN par du SYBR green I sur gel d’électrophorèse de poly-acrylamide par Singer VL.
1995: Premier marquage de produit de RT-PCR sur gel d’électrophorèse d’agarose par Schneeberger CS.
1995: Première révélation de courtes répétitions en tandem sur gel de polyacrylamide avec une méthode non radioactive par Morin PA.
1995: Première détection des nucléases en gel sensible avec du SYBR green I par Jin X.
1997: Dépôt du brevet américain no5658751 sur les cyanines asymétriques par Molecular Probes. Le SYBR green I semble être le composant no937.
1997: Première détection des ADN endommagés sur gels d'agarose en champs pulsés par Kiltie AE.
1998: Première quantification de l'activité des nucléases en diffusion radiale par Yasuda T.
2000: Détection de virus en cytométrie de flux avec du SYBR green I par Brussaard CP.
2001: quantification de l’ADN double brin en extraits bruts sur échantillons environnementaux par Bachoon DS.
2004: Publication de la structure et de variabilité du spectre d’émission du SYBR green I par Zipper H.
Toxicité et consigne de sécurité
Le SYBR Green présente une mutagénicité non nulle mais cependant très inférieure au bromure d'éthidium.
Les précautions d'usage doivent être néanmoins conservées.
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Bibliographie anglophone
Ames BN, McCann J, Yamasaki E, Methods for detecting carcinogens and mutagens with the Salmonella/mammalian-microsome mutagenicity test. 1975, Mutation Research 31:347–364.
Bachoon DS, Otero E, Hodson RE, Effects of humic substances on fluorometric DNA quantification and DNA hybridization. 2001. J. Microbiol. Methods, 47:73–82.
Brussaard CP, Marie D, Bratbak G, Flow cytometric detection of viruses. 2000. J. Virol. Methods, 85:175–182
Jin X, Yue S, Wells KS, Singer VL, SYBRTM Green I: a new fluorescent dye optimized for detection of picogram amounts of DNA in gels. 1994. Biophys. J. 66:A159.
Jin X, Yue S, Singer VL, Highly sensitive gel assays for detecting nucleases. 1995. FASEB J. 9:A1400.
Kiltie AE, Ryan AJ, SYBR Green I staining of pulsed field agarose gels is a sensitive and inexpensive way of quantitating DNA double-strand breaks in mammalian cells. 1997. Nucleic Acids Res. 25:2945–2946.
Maron DM, Ames B, Revised methods for the Salmonella mutagenicity test, 1983, Mutation Research 113:173–215.
Morin PA, Smith DG, Nonradioactive detection of hypervariable simple sequence repeats in short polyacrylamide gels. 1995. BioTechniques 19:223–227.
Ohta T, Tokishita S, Yamagata H, Ethidium bromide and SYBR Green I enhance the genotoxicity of UV-irradiation and chemical mutagens in E. coli. 2001, Mutation Research, ; 492(1-2):91-7.
Rye HS, Yue S, Wemmer DE, Quesada MA, Haugland RP, Mathies RA, Glazer AN, Stable fluorescent complexes of double-stranded DNA with bis-intercalating asymmetric cyanine dyes: properties and applications. 1992. Nucleic Acids Res. 20:2803–2812.
Schneeberger CS, Speiser P, Kury F, Zeillinger R, Quantitative detection of reverse transcriptase–PCR products by means of a novel and sensitive DNA stain, PCR Methods. 1995. Appl. 4 :234–238.
Singer VL, Jin X, Ryan D, Yue S, SYBRTM Green dyes: ultrasensitive stains for detection of DNA and RNA in electrophoretic gels. 1994. Biomed. Products 19:68–72.
Singer VL, Lawlor TE, Yue S, Comparison of SYBR Green I nucleic acid gel stain mutagenicity and ethidium bromide mutagenicity in the Salmonella/mammalian microsome reverse mutation assay (Ames test). 1999, Mutation Research 439:37–47.
Skeidsvoll J, Ueland PM, Analysis of double-stranded DNA by capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection using the monomeric dye SYBR Green I. 1995. Anal. Biochem. 231:359–365.
Yasuda T, Takeshita H, Nakazato E, Nakajima O, Hosomi O, Nakashima Y, Kishi K, Activity measurement for deoxyribonucleases I and II with picogram sensitivity based on DNA SYBR Green I fluorescence. 1998. Anal. Biochem. 255:274–276.
Zipper H, Brunner H, Bernhagen J, Vitzthum F, Investigations on DNA intercalation and surface binding by SYBR Green I, its structure determination and methodological implications. 2004. Nucleic Acids Res.; 32:e103.
