Southern blot

 Ez a szócikk nem tünteti fel a független forrásokat, amelyeket felhasználtak a készítése során. Emiatt nem tudjuk közvetlenül ellenőrizni, hogy a szócikkben szereplő állítások helytállóak-e. Segíts megbízható forrásokat találni az állításokhoz! Lásd még: A Wikipédia nem az első közlés helye. (2022 szeptemberéből)
Agaróz gél membránra helyezése az elektroforézis után.

A Southern blot egy molekuláris biológiai módszer, aminek segítségével az adott DNS mintából specifikus DNS szakaszok kimutatása válik lehetővé. A módszer során az agaróz gélelektroforézis teszi lehetővé a DNS szakaszok méret szerinti elválasztását, majd az így kapott frakciókat általában nitrocellulóz membránon kötik meg (blottolás). A membránon az elválasztással kapott mintázat és a specifikus szekvenciát tartalmazó DNS szakaszok nyomai is láthatóvá tehetők a megfelelő festékekkel. A vizsgálat eredményét általában a membrán szkennelésével vagy fotózásával (radioaktív jelölőanyag esetén röntgenfilmmel) dokumentálják.

A módszert Edwin M. Southern brit biológusról nevezték el, aki 1975-ös cikkében először írta le a technika alapjait. Az ötlete nem csak a DNS vizsgálatában hozott áttörést, mivel következő években a munkafolyamat kisebb módosításokkal számos másik biomolekula elválasztására és analízisére is alkalmasnak bizonyult. Ezek az ún. blottolásos (blotting) módszerek az eredeti feltaláló neve után szintén égtájak angol nevét kapták.

Módszer neve Leírás éve Gélmátrix anyaga Membrán anyaga Felhasználás
Southern blot 1975 agaróz nitrocellulóz, nylon DNS szakaszok elválasztása méret alapján és a specifikus szekvenciát tartalmazók detektálása
Northern blot 1975 agaróz formaldehiddel nylon RNS szakaszok elválasztása méret alapján és a specifikus szekvenciát tartalmazók detektálása
Western blot 1979 poliakrilamid polivinilidén-fluorid (PVDP), nirocellulóz Fehérjék és polipeptidek elválasztása méret alapján és a specifikus szerkezettel rendelkezők detektálása
Southwestern blot 1980 poliakrilamid nirocellulóz DNS-hez kötődő fehérjék elválasztása méret alapján és különböző DNS szekvenciákat vagy peptidszerkezeteket tartalmazó komplexek detektálása.
Eastern blot 1982 poliakrilamid polivinilidén-fluorid (PVDP), nirocellulóz Fehérjék és polipeptidek elválasztása méret alapján és a különböző poszttranszlációs módosulásokkal rendelkezők detektálása
Northwestern blot 1984 poliakrilamid nirocellulóz RNS-hez kötődő fehérjék elválasztása méret alapján és különböző RNS szekvenciákat vagy peptidszerkezeteket tartalmazó komplexek detektálása.
Far-western blot 1994 poliakrilamid polivinilidén-fluorid (PVDP), nirocellulóz Fehérjekomplexek elválasztása méret alapján és a különböző fehérje-fehérje kölcsönhatások
Far-eastern blot 2000 Lipidekhez kapcsolódó oligoszacharidok elválasztása méret alapján és a különböző lipid-oligoszacharid kölcönhatások detektálása

A módszer

  1. A nagyobb (akár genomi méretű) DNS-t kisebb szakaszokra hasítják restrikciós endonukleázok segítségével.
  2. A DNS-t ezután denaturálják nátrium-hidroxid segítségével, melynek következtében a DNS két szála elválik egymástól.
  3. Nitrocellulóz vagy nylon membránt helyeznek a gél tetejére, amire több rétegben papírtörölköző kerül. A kapillárishatás miatt a minták felfelé mozdulnak el, kikötődnek a membránra, megőrizve a gélbeli egymáshoz viszonyított helyzetüket.
  4. Nitrocellulóz membrán esetében száraz hőkezelés (60-100 °C), nylonmembrán esetében UV kezelés következik, ekkor történik meg a DNS-membrán kovalens keresztkötése.
  5. Majd a membránt hibridizációs jelzővegyülettel (probe) kezelik – ami egy olyan specifikus szekvenciával rendelkező DNS molekula, mely a vizsgálni kívánt szakasszal komplementer, és radioaktív izotópot tartalmazó, fluoreszcens vagy kromogenikus (bizonyos körülmények között színessé tehető) funkciós csoporttal van ellátva.
  6. A nem hibridizált jelzővegyületeket lemossák a felületről, és a hibridizációs mintázatot Röntgen-filmen autoradiográfiával vagy fluorescens jelölés esetén fluorométerrel, esetleg a kromogén szubsztát alkalmazásával enzimatikus színreakcióval teszik láthatóvá.

Az eredmény

A próba megmutatja, hogy az elektroforetikus elválasztás mely fragmentumai tartalmaznak egy bizonyos DNS szekvenciát.

Jegyzetek

  1. ↑ E. M. Southern (1975. november 5.). "Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis". Journal of Molecular Biology. 98 (3): 503–508. doi:10.1016/S0022-2836(75)80083-0. PMID 1195397. Hozzáférés: 2026. április 17.

Kapcsolódó szócikkek