Star Trek
Majel Barrett har vært med i alle utgavene av science fiction-universet Star Trek. Hun var med i piloten til Star Trek', «The Cage», da som nestkommanderende på USS Enterprise NCC-1701, men uten navn, bare som «Number One». Barrett ble etter sigende gitt rollen, på grunn av sitt romantiske forhold til Roddenberry. Tanken om å ha en ukjent kvinne i en hovedrolle med en autoritær posisjon bare fordi hun var romantisk involvert med Roddenberry, hisset opp sjefene i NBC som insisterte på at Roddenberry ga rollen til en mann. I Star Trek Memories, som han dikterte til Chris Kreski, bekrefter William Shatner dette, men han legger til at kvinnelige seere på test-visninger også hatet rollefiguren. Shatner sa også at kvinnelige seere mente at hun var «irriterende» og at «Number One shouldn't be trying so hard to fit in with the men. Restrospect [today], it would seem, is not always pleasant».
Majels rolle i flere episoder av Star Trek ble endret til sykepleieren Christine Chapel. I en tidlig scene i Star Trek: The Motion Picture, blir seerne informert om at hun nå er Doctor Chapel, en rolle hun gjentar i Star Trek IV: The Voyage Home. Barrett bidrar også med flere stemmer til animasjons-serien Star Trek: The Animated Series, inklusive Christine Chapel og kommunikasjons-offiseren M'Ress som tjenestegjør sammen med Uhura (mest kjent fra Star Trek: The Motion Picture). Flere år senere returnerte Barrett til Star Trek: The Next Generation som den spesielle og utagerende Betazoid-ambassadøren Lwaxana Troi – moren til Deanna Troi. Barrett som Troi, gjentok denne rollen i flere episoder av Star Trek: Deep Space Nine.
Majel Barrett bidro også med stemmen til datamaskinen om bord, for Star Trek: The Original Series, Star Trek: The Next Generation, Star Trek: Deep Space Nine, Star Trek: Voyager, og i flere av Star Trek-filmene. Hun gjentok stemmerollen i to episoder av Star Trek: Enterprise, som involverte en tidligere tidsperiode, før tiden til Kirk og Spock. Hun har også brukt stemmen sin på flere Star Trek-videospill.
Etter Star Trek
Majel Barrett hadde rollen som Primus Dominic i Roddenberrys post-apokalyptiske TV-drama pilot, «Genesis II».
Etter Roddenberrys død, brukte Barrett materiale fra hans arkiver til å gi liv til to av dem. Hun var produksjonsleder til Earth: Final Conflict og senere Andromeda.
Barrett spilte også rollefiguren Dr. Julianne Belman i Earth: Final Conflict. Hun gjorde en gjesteopptreden i Babylon 5 som Lady Morella, en synsk enke av den centauriske keiseren; hennes rolle kom med forhåndsvarlser om flere plot i serien. Hun gjorde også en parodi på sin computer-stemme i animasjonsserien Family Guy som stemmen til «Stewie Griffin» sitt romskip.
Union Pacifics jernbaneingeniører har brukt stemmen til Barrett på sitt utstyr for å varsle om feil, og på flere Union Pacific jernbanelokaliteter vest for Mississippi. Når en feil blir oppdaget, vil systemet bruke stemmen til Barrett for å informere mannskapet om bord.
