Proteoomika

Valkude summaarse kontsentratsiooni määramine

Valkude kogusisalduse määramiseks kasutatakse enamasti kolorimeetrilisi ehk lahuse värvimuutusel põhinevaid meetodeid, kus värvaine neelduvus teatud nähtava ala lainepikkuse juures (mida inimsilm tunnetab värvina) oleneb valgusisaldusest lahuses. Üks tuntumaid ja tehniliselt lihtsamaid lahendusi on nn Bradfordi meetod, kus kesksel kohal on värvaine Coomassie Brilliant Blue G-250. Happelises keskkonnas on selle värvaine kahe suhteliselt nõrga neeldumismaksimumiga (465 nm ja 645 nm), kuid lisamisel valgulahusesse moodustab see mittekovalentset kompleksi valkude positiivselt laetud aminorühmadega ja aromaatsete aminohappejääkide külgrühmadega. Sellega kaasneb värvi neeldumisspektri maksimumi muutumine: värvi kompleks valguga neelab tugevalt 595 nm juures, andes lahusele iseloomuliku sinise värvuse. Beeri-Lamberti seaduse kohaselt on neelduvus võrdelises sõltuvuses kompleksi kontsentratsiooniga (kui kontsentratsioon ei ole liiga väike ega liiga suur), mistõttu lahuse valgusisaldust saab tuvastada, mõõtes lahuse neelduvust 595 nm juures. Kuna Bradfordi meetod on tundlik proovi maatriksi komponentide suhtes, kasutatakse mõõtmistes sageli kalibratsioonigraafikut, mõõtes valguse neelduvust kõigepealt tuntud valgusisaldusega proovides, millele on lisatud Coomassie Brilliant Blue G-250. Enamasti kasutatakse kalibreerimiseks mõnda hästi kättesaadavat odavat valku (nt veise seerumi albumiin), kuigi see ei pruugi analüüsitava valkude segu omadusi täpselt modelleerida. Nagu kõik kolorimeetrilised meetodid, ei sobi Bradfordi meetod häguste proovide (suspensioonid jms) korral, kuna valguse hajumine tingib neelduvuse näiliselt suuremat väärtust.

Vaatamata oma piirangutele, on Bradfordi meetodi lihtsus (kvalitatiivne hinnang on võimalik ka visuaalse vaatluse teel), kiirus (mõõtmised on teostatavad mõne minutiga) ja tundlikkus (meetodiga saab määrata valgusisaldust suurusjärgus 2–20 μg/mL) teinud seda väga populaarseks. 2. detsembri 2022 seisuga on teaduskirjanduse andmebaasi Clarivate Analytics Web of Science info kohaselt Marian M. Bradfordi originaalpublikatsioonile viidatud peaaegu 240 000 korda. Kliinilistest rakendustest saab Bradfordi meetodit kasutada uriiniproovide valgusisalduse analüüsiks: tavaliselt peaks valgusisaldus uriinis olema suhteliselt väike (alla 150 mg valku päevas), kuid neerude halvenenud funktsiooni korral võib see oluliselt suureneda (makroproteinuuria korral üle 300 mg valku päevas ehk üle 150 mg valku liitri uriini kohta). Oluliselt laialdasem on aga Bradfordi meetodi kasutamine baasteaduslikes uuringutes, võrdlemaks valkude kogusisaldust proovides, mis erinevad suuruselt oluliselt (näiteks eri patsientide biopsiaproovides) – sel viisil on võimalik teostada järgnev katseseeria viisil, kus võetakse arvesse proovi suhtelisest suurusest tingitud erinevusi.

Veel üks kolorimeetriline meetod, mille abil saab määrata valkude kogusisaldust homogeenses proovis, on nn Lowry meetod. See meetod kasutab värvainena nn Folini-Ciocalteu reagenti (fosfomolübdaadi ja fosfovolframaadi segu), mis moodustab värvilisi kompleksi valgu koosseisu kuuluvate aminohappejääkidega Cys, Trp ja Tyr. Seejuures peavad need aminohappejäägid olema eelnevalt oksüdeeritud, mis saavutatakse eelnevalt Cu²⁺ ioonide toimel aluselises keskkonnas (vaseioon redutseerub oksüdatsiooniastmeni +1). Ka see meetod on väga populaarne: 2. detsembri 2022 seisuga on Oliver H. Lowry originaalsele publikatsioonile viidatud teaduskirjanduse andmebaasi Clarivate Analytics Web of Science info kohaselt kokku üle 350 000 korra.

Proovi eeltöötlus

Kuigi mõne allpool käsitletud meetodi korral kasutatakse proovina terveid rakke või isegi koetükke, on paljude meetodite puhul (nt kromatograafia, elektroforees, mõned ELISA rakendused jms) enamasti vajalik bioloogilise proovi täiendav ettevalmistus. See võib koosneda mitmest etapist, mis hõlmavad näiteks järgmisi võtteid:

• Ebaühtlase ehk mittehomogeense (nt tahkest ja vedelast osast koosneva) proovi homogeniseerimine mehaanilise peenestamise abil või kasutades ultraheli.
• Proovi jaotamine osadeks, kasutades sadestamist ja tsentrifuugimist – näiteks membraansed struktuurid või suured DNA molekulid lahustuvad veepõhistes puhverlahustes halvemini kui tsütosoolsed valgud; seevastu atsetonitriilis valgud ei lahustu, kuid orgaanilisse faasi liiguvad väiksema molekulmassiga hüdrofoobsed ained. Tsentrifuugimisel lahutatakse lahustuv osa mittelahustuvast, kasutades ära tiheduste erinevusi.
• Ekstraheerimise ja kromatograafia vahepealne tehnika, kus kasutatakse hüdrofoobsetest (pikkade alküülahelatega derivatiseeritud) materjalidest valmistatud filtritega pipetiotsikuid – proovi pipeteerimisel kinnituvad hüdrofoobsemad komponendid filtri külge ning hüdrofiilsemad jäävad lahusesse.
• Dialüüs, kasutades poorseid membraane – viimased võimaldavad väikese molekulmassiga molekulidel difusiooniliselt liikuda dialüüsitava lahuse ja suurema ümbritseva lahuse (dialüsaadi) vahel kuni kontsentratsiooni ühtlustumiseni, kuid suure molekulmassiga molekulid (nt valgud) jäävad membraaniga ümbritsetud alasse.
• Lüofiliseerimine ehk külmkuivatus, kus proovi hoitakse madalal temperatuuril vaakumis. Madala rõhu tingimustes lahkuvad proovist lenduvad ja madalama keemistemperatuuriga komponendid (enamasti sealhulgas ka vesi) ning valgud säilitavad samas madalal temperatuuril suurema tõenäosusega oma ruumilist struktuuri. Lüofiliseerimine on pehme viis, kuidas suurendada proovis valgusisaldust, kuid see ei sobi mittelenduvaid soolasid sisaldavate proovide jaoks ning ei garanteeri siiski näiteks ensümaatilise aktiivsuse säilimist lüofiliseeritud proovis (isegi pärast proovi taaslahustamist vees).

Lahutamistehnikad: kromatograafia liigid

Kromatograafia on väga mitmekesiste meetodite kogum, mis on üldiselt kasutatavad eri komponentide lahutamiseks segude analüüsil. Neid meetodeid ühendab asjaolu, et komponentide lahutuseks kasutatakse kaks eri faasi (statsionaarne ehk mitteliikuv ning mobiilne ehk liikuv), kusjuures lahutamine toimub tänu sellele, et eri komponendid püsivad eelistatult kas statsionaarse faasi külge kinnitununa või mobiilses faasis lahustununa. Statsionaarne faas võib olla kas kahemõõtmeline (nn planaarkromatograafia) või kolmemõõtmeline (nn kolonnkromatograafia) ning lahutus on üldiselt seda efektiivsem, mida rohkem on võimalik meetodi disainis võimaldada analüüdi üleminekuid statsionaarse ja mobiilse faasi vahel (kasutades nt poorseid või peeneteralisi täidiseid statsionaarse faasina). Mobiilne faas võib aga olla kas vedelas või gaasilises agregaatolekus. Proteoomikas kasutatakse enamasti kõrgrõhu-vedelikkromatograafiat (ingl k high-pressure liquid chromatography või ka high-performance liquid chromatography ehk HPLC), kus vedelat mobiilset faasi surutakse läbi peeneteralise täidisega täidetud kolonnist. Ultra-HPLC puhul kasutatakse näiteks rõhku üle 1000 atmosfääri ning kolonni täidise suurus on mikromeetri suurusjärgus. Vastastikmõjude tüüpe, mis tagavad lahutatavate komponentide kinnitumist statsionaarse faasi külge, on mitmeid:

• Aine hüdrofiilsus/hüdrofoobsus: polaarsemad ained püsivad pikemat aega polaarsemas faasis, vähem polaarsemad vastavalt vähem polaarses faasis. Kuna valgud on suhteliselt suure molekulmassi ning keerulise ruumilise kujuga molekulid, teostatakse sageli enne analüüsi valgu denatureerimine (ruumilise struktuuri lagundamine tingimustes, kus primaarstruktuur jääb alles) ning seejärel osaline proteolüüs suure puhtusega proteaasidega (nt trüpsiiniga). Kuigi valgud ja nende lagundamisel saadavad peptiidid on üsna polaarsed, oleneb nende hüdrofiilsus ja hüdrofoobsus siiski molekuli moodustavate aminohappejääkide külgahelas olevates funktsionaalrühmadest. Proteoomikas kasutatakse enamasti nn pöördfaas-kromatograafiat (ingl k reverse-phase high-pressure liquid chromatography ehk RP-HPLC), kus statsionaarne faas on vähepolaarne ning mobiilne faas polaarne. Kuna lisaks valkudele võivad bioloogilised proovid sisaldada suures hulgas väiksemaid molekule, mis võivad raskendada RP-HPLC protsessi või peptiidi hilisemat tuvastamist ning kuna RP-HPLC kolonne soovitakse võimalikult kaua korduvkasutada, tehakse enne RP-HPLC-d sageli proovi eelnev põhjalik eeltöötlus.
• Molekuli suurus: kuigi valgumolekuli ruumilised mõõtmed sõltuvad nii primaarsest struktuurist (ehk mitu aminohappejääki valk sisaldab) kui ka kõrgemat järku struktuuridest (ehk kuidas valgumolekul voltub), saab valkude segus teostada teatud lähenduses komponentide „sorteerimist“ suhtelise suuruse järgi, kasutades poorseid täidiseid või membraane. Suuruseralduskromatograafia (ingl k size exclusion chromatography ehk SEC) puhul liigub lahutatavate valkude segu läbi poorse täidisega kolonni, kusjuures väiksema molekulmassiga valgud jäävad pooridesse pikemaks ajaks „lõksu“ ning seepärast väljuvad kolonnist hiljem kui suurema molekulmassiga valgud, mis pooridesse ei mahu. Saavutatav lahutus on siiski suhteline ning eri tüüpi valkude eraldamiseks tuleb teostada meetodi eelnev optimeerimine, kasutades teadaolevate molekulmassidega võrdlusaineid. Mõnevõrra sarnaneb sellega ultrafiltreerimine (UF), kuid selle puhul kasutatakse poorseid membraane ning seejuures toimib membraan filtrina, lastes läbi vaid teatud piirmäärast väiksemaid molekule. Nii SEC kui ka UF puhul kasutatakse protsessi kiirendamiseks sageli süsteemi tsentrifuugimist, kus proov „surutakse“ läbi kolonni/membraani tsentrifugaaljõu toimel.
• Molekuli võime moodustada spetsiifilisemaid suunatud vastastikmõjusid: enamik valkudest peab oma rolli täitmiseks organismis moodustama vastastikmõjusid teiste valkudega ning muude molekulidega – seejuures tekib unikaalne vastastikmõjude muster, mille alusel saab eristada sobivat sidumispartnerit mittesobivast. Seda omadust kasutatakse ära afiinsuskromatograafias, kus statsionaarse faasi külge kinnitatakse huvipakkuva valgu mõni sidumispartner (näiteks proteiinkinaasi A eraldamiseks saab kasutada selle looduslikku termostabiilset inhibiitorit PKI). Tulemuseks moodustab statsionaarse faasiga tugevaid vastastikmõjusid eelistatult huvipakkuv valk ning suurem osa muudest proovi komponentidest läbib kolonni üsna kiirelt, statsionaarse faasiga vastastikmõjusid peaaegu moodustamata. Järgnevaks sammuks on huvipakkuva valgu eemaldamine kolonnist (elueerimine), milleks kasutatakse erinevaid mooduseid – igal juhul tuleb aga nõrgendada vastastikmõjusid valgu ja selle sidumispartneri vahel. Selleks võib muuta mobiilse faasi pH väärtust, ioontugevust või lisada mobiilsele faasile mõnda ainet, mis võib samuti huvipakkuva valguga vastastikmõjusid moodustada, pakkudes sel viisil konkurentsi statsionaarse faasi omadustele (näiteks proteiinkinaasi A elueerimiseks PKI-afiinsustäidisest kasutatakse arginiini lisamist mobiilsesse faasi, mis konkureerib PKI-ga). Samuti võib statsionaarse faasi külge kinnitada näiteks antikehi, mis seovad selektiivselt just sihtmärkvalku.

Kromatograafiat teostatakse kas analüütilistel (st tuvastada segus sisalduvate komponentide arvu ja olemust) või preparatiivsetel (st füüsiliselt eraldada üks komponent teistest) eesmärkidel. Näiteks on RP-HPLC proteoomikas enamasti analüütilise, aga suuruseralduskromatograafia ja afiinsuskromatograafia vastupidi preparatiivse eesmärgiga. Seepärast on vaja kromatograafiat enamasti kombineerida erinevat tüüpi detektoritega (seadmetega, mis mõõdavad kolonni väljundis teatud signaali). Olenevalt konkreetsest meetodist võivad selleks sobida kas optilised detektorid (nt dioodrivi, mis registreerib ultravioletse ja nähtava ala elektromagnetkiirguse neeldumist kolonnist väljuvas lahuses) või massispektromeetrilised detektorid (registreerivad kolonnist väljuvas lahuses sisalduvate molekulide ioniseerumisel tekkivate osakeste massi ja laengu suhet ehk m/z väärtust). Analüütilises proteoomikas kasutatakse enamasti just massispektromeetrilisi detektoreid, kuna nende suure lahutusvõime tõttu on osakese jaoks tuvastatava m/z väärtuse põhjal võimalik suure täpsusega prognoosida osakese brutovalemit. Preparatiivses proteoomikas on üheks lähenemiseks ka mitmete kolonnist väljunud lahuseportsude (fraktsioonide) kogumine, kust hiljem ohverdatakse osa muude meetodite jaoks (nt Coomassiega värvimine, vt alapealkiri eespool), mis võimaldavad kindlamalt tuvastada analüüdi olemasolu igas kogutud fraktsioonis.

Valkude uuringute teostamiseks on kromatograafilisi meetodeid täiustatud ja kombineeritud omavahel ja teiste tehnikatega eri viisidel, mis võimaldavad:

A) vähendada kasutatava proovi kogust (see on oluline näiteks patsientide proovidega töötamisel, kus bioloogilise materjali koguhulk võib olla piiratud mõne milligrammiga),

B) kiirendada analüüsi (kümne proovi skaalal ühe ööpäeva jooksul, kusjuures igas proovis tuvastatakse tuhandetele valkudele vastavaid peptiide) ning

C) tuvastada analüüte, mille sisaldus proovis on väga väike (0,1–10 pikogrammi ühe milliliitri algse proovi kohta).

Lahutamistehnikad: elektroforees

Valkude segu saab lahutada ka geelelektroforeesi abil, kasutades laetud molekulide liikumist elektriväljas läbi poorse polüakrüülamiidist koosneva geeli (ingl k polyacrylamide gel electrophoresis ehk PAGE). Seejuures saab ära kasutada kas valgumolekulide „olemuslikku“ laengut, mis tuleneb mõnede aminohappejääkide külgahelates ja valgumolekuli terminaalides paiknevatest laetud funktsionaalrühmadest, või anda valgumolekulidele lisalaengut, kasutades pindaktiivset ainet naatriumdodetsüülsulfaati (ingl k sodium dodecylsulphate, SDS). PAGE jaoks kasutatav elektrivälja tagav seade on sisuliselt elektrolüüser: välise energiaallika abil tekitatakse seadme ühel elektroodil (anoodil) positiivne ja teisel elektroodil (katoodil) negatiivne laeng.

1D-elektroforees

Ühemõõtmelise PAGE puhul segatakse valke sisaldav piisavalt homogeenne proov SDS-iga. SDS seostub valgumolekuliga, lineariseerides seda (denatureerimise teel) ning andes iga aminohappejäägi kohta võrdse arvu negatiivseid laenguid (keskkonna pH juures, mis jääb vahemikku 6,8–8,8). Valgumolekulide denatureerimisele aitab kaasa ka proovi eeltöötlus kõrgel temperatuuril (75–95 °C) ning redutseerivate ainete (nt tioolide) lisamine, mis taandavad ära molekulisisesed ja molekulidevahelised disulfiidsidemed. Negatiivselt laetud valkude segu pannakse seejärel elektrivälja toimel liikuma läbi poorse geeli positiivselt laetud elektroodi poole: väiksema molekulmassiga valgud liiguvad seejuures pooridest läbi kiiremini kui suuremad. Lahutumisele aitavad kaasa ka geelis ja foreesipuhvris sisalduvad komponendid (nt trisaminometaan ehk Tris ja glütsiin). Tulemusena saavutatakse valkude segu lahutumine vastavalt molekulmassile. 1D-PAGE järel saab valgumolekule asukohta geelis visualiseerida valke siduva värvaine Coomassie abil (vt eespool alapealkiri „Valkude summaarse kontsentratsiooni määramine“). Ühte kindlat huvipakkuvat valku saab samuti tuvastada PAGE jooksul lahutatud valkude ülekandmise järel õhemale membraanile (membraani materjaliks on kas nitrotselluloos või polüvinülideenfluoriid), millele järgneb värving selektiivse antikehaga.

2D-elektroforees

Kahemõõtmelise PAGE puhul toimub lahutamise esimeses etapis valkude segu liikumine elektrivälja toimel läbi polüakrüülamiidist geeliriba, mille eri piirkondadele on omane erinev pH (pH väärtuste sujuva ülemineku tagamiseks lisatakse geeli valmistamisel segusse segu polüaminokarboksüülhapetest, mis omavad erinevat happelisust). Seda lähenemist nimetatakse ka isoelektriliseks fokuseerimiseks. Meetodi läbiviimisel kasutatakse ära asjaolu, et valgumolekuli koosseisu kuuluvad karboksüülrühmad ja aminorühmad võivad vastavalt oma happelisus-aluselistele omadustele olenevalt keskkonna pH-st kas deprotoneeruda või protoneeruda. Seejuures on iga valgumolekuli puhul olemas iseloomulik pH väärtus (nn isoelektriline punkt ehk pI), mille juures valgumolekuli summaarne laeng on võrdne nulliga. Kui valgumolekul jõuab geeliribast läbimineku jooksul asukohta, mille pH on võrdne valgumolekuli pI-ga, siis valgumolekul edasi ei liigu. Sel viisil saavutatakse esmalt valkude segu lahutumine vastavalt sellest sisalduvate aminohappejääkide happeliste või aluseliste omaduste ülekaalule.

Isoelektrilise fokuseerimise järel asetatakse ühes mõõtmes lahutatud valkudega geeliriba SDS-sisaldava polüakrüülamiidgeeli sisse ning lastakse SDS molekulidel valkudega seostuda. Seejärel teostatakse valkude segu lahutamine vastavalt molekulmassile, kasutades SDS-iga seotud valkude liikumist suunas, mis on risti, võrreldes isoelektrilise fokuseerimise suunaga. Seega sarnaneb 2D-PAGE teine etapp 1D-PAGE põhimõttega.

Kuigi 2D-PAGE järel saaks lahutatud valke visualiseerida sarnaselt 1D-PAGE puhul mainitud lähenemistega, kasutatakse 2D-PAGE sageli nn geelisiseselt eristava elektroforeesi (ingl k differential in-gel electrophoresis) ehk DIGE-formaadis. DIGE-formaat võimaldab korraga lahutada kahest võrreldavast proovist pärit valke, kuna enne elektroforeesi teostatakse valgumolekulide kovalentne ühendamine fluorestsentsvärviga (seejuures kasutatakse kahe eri proovi jaoks erinevate optiliste omadustega värve, nt Cy3 ja Cy5). On oluline, et fluorestsentsvärvid ei muuda oluliselt lahutatavate valkude happelis-aluselisi omadusi ega molekulmassi. Seega saab 2D-PAGE järel saab võrrelda, kas geeli ühes piirkonnas esineb mõlema fluorestsentsvärvi signaal (sel juhul sisaldasid mõlemad proovid sellist valku, mille pI ja molekulmass võimaldasid molekulil 2D-PAGE käigus just antud asukohta jõuda) või ülekaaluliselt ainult ühe fluorestsentsvärvi signaal (sel juhul sisaldub huvipakkuv valk suuremas kontsentratsioonis ühes proovidest). Võrdluse tulemusena selgunud huvipakkuvaid valke saab seejärel täpselt tuvastada, kasutades massispektromeetriat.

Massispektromeetria proteoomi uuringutes

Massispektromeetria võimaldab lahutada gaasifaasis viibivaid ioone, kasutades ioonide liikumist magnetväljas, kuna iooni trajektoori pikkus ja/või kuju oleneb selle massi (m) ja laengu (z) suhte väärtusest. Kuivõrd kõrglahutusega massispektromeeter on suuteline tuvastama m/z väärtusi täpsusega kolm-neli kohta pärast koma (daltoni skaalal), siis sisuliselt on mõõdetud signaalide alusel võimalik kindlaks teha tuvastatud ioonide brutovalemid, sest süsteem on piisavalt tundlik, et eristada omavahel sama elemendi isotoope. Olenevalt konkreetsest proovist ja uurimistöö eesmärgist, kasutatakse proteoomikas nii ionisatsioonimeetodeid (elektropihustus e ESI, abimaatriksiga laserdesorptsioon e MALDI) kui ka massianalüsaatoreid (kvadrupool e Q, ioontsüklotron-resonants e ICR, lennuaeg e TOF). Valkude massispektromeetrilisel analüüsil lagundatakse valgud sageli eelnevalt peptiidideks, kuigi teatud meetodid võimaldavad lihtsamates proovides kindlaks teha ka lagundamata molekuli protoneerumisel tekkivate molekulaarioonide m/z väärtusi. Lihtsustamaks peptiidi aminohappelise järjestuse määramist, kasutatakse ka analüüsitud peptiidide edasist fragmenteerimist otse massispektromeetris, tekitades sellega peptiidist terve komplekti lühemaid ioone, mille m/z väärtuste alusel on võimalik tuvastada üksikuid aminohappejääke ja nende järjestikust paiknemist peptiidis. Sel viisil on massispektromeetria asendanud valkude ja peptiidide sekveneerimisel ajaloolist Edmani meetodit. Tuvastamaks valke, millest identifitseeritud järjestusega peptiidid pärinevad, kasutatakse proteoomika andmebaase (nt UniProt).

Massispektromeetriale eelneva proovitöötluse alusel võib proteoomikas eristada kaht põhilist lähenemist:

• Nn alt üles (ingl k bottom-up) lähenemine – bioloogiline proov (nt rakud, kude vms) homogeniseeritakse, rikastatakse valgusisalduse poolest ning valgud lagundatakse proteolüütiliselt (nt trüpsiini abil). Saadud peptiidide segu süstitakse kromatograafi, kust lahutatud peptiidid suunatakse edasi ESI-massispektromeetrisse. Sel viisil teostatakse suur osa nn märgistamata analüüsidest (ingl k label-free proteomics), st valke ei derivatiseerita täiendavalt. Sama valgu sisaldust eri proovides on võimalik kvantitatiivselt võrrelda, kui teha igas proovis kindlaks huvipakkuvale valgule vastava signaali intensiivsuse suhet kõigi proovis tuvastatud signaalide intensiivsusesse. Samas proovis ei ole eri valkude sisaldus samas võrreldav, sest eri peptiidid ioniseeruvad erineva efektiivsusega.
• Nn ülevalt alla (ingl k top to bottom) lähenemine – bioloogiline proov (nt rakud, kude vms) homogeniseeritakse, suurendatakse selle valgusisaldust ning valkude segu lahutatakse 2D-elektroforeesi teel. Saadud geelist saab välja lõigata riba, milles prognoositavalt (arvutuslikult või varem eksperimentaalsel teel määratud isoelektrilise punkti ja molekulmassi alusel) asub huvipakkuvale valgule vastav „laik“. Seejärel ekstraheeritakse valk geelist ning suunatakse massispektromeetrilisse analüüsi. Sel viisil teostatakse sageli paralleelselt mitme proovi analüüs, kusjuures enne geelelektroforeesi märgistatakse proovides valgud märgistamine fluorestsentsvärvidega (iga proovi jaoks valitakse eristuvate spektraalomadustega värv, et geeli peal saaks kindlaks teha, milliste „laikude“ intensiivsused on eri proovides oluliselt erinevad).

Olenevalt uurimistöö eesmärgist ja kättesaadava proovi hulgast saab kasutada ka täiendavaid meetmeid, tagamaks massispektromeetrilise analüüsi täpsust. Näiteks juhul, kui tahetakse keskenduda ainult teatud translatsioonijärgse modifikatsiooniga valkude analüüsile, saab proovi eelnevalt rikastada, kasutades afiinsuskromatograafiat või puhastamist titaandioksiidi osakestega (fosforüülitud valkude jaoks). Analüüsi kvantitiivsuse ja tundlikkuse suurendamiseks saab valke derivatiseerida – kas staadiumis, kus valgud on kasvavates rakkudes (kasutades isotooprikastatud söötmeid), või homogeniseerimise järel (kasutades nn isobaarseid märgiseid, ingl k isobaric tags).

Voolutsütomeetria

Voolutsütomeetria näol on tegemist meetodiga, mis vaatleb valke rakkude kontekstis. Uuritavaks prooviks on rakkude suspensioon, milles rakud võivad püsida ka elusana (ehk meetod ei vaja bioloogilise terviklikkuse kaotamist). Rakususpensioon juhitakse läbi klaaskapillaari, mille peensus võimaldab saavutada olukorda, kus kapillaarist läbivoolava vedeliku teatud ruumalas (ligi 10^–9 liitrit) saab korraga viibida ainult üks rakk. Osale kapillaarist fokuseeritakse laseri valgus ja registreeritakse tekkinud valgustäpis (ligi 50–60 μm läbimõõduga) koos vedelikuga kapillaari läbivate rakkude omadusi. Selleks mõõdetakse valguse hajumist kahes sihis: nn otsehajumine (ingl k forward scatter) ja hajumine külgsuunas (ingl k side scatter).

Otsehajumist mõõtev detektor registreerib seda suuremat signaali muutust, mida suurem objekt kapillaari läbib (sest suur objekt takistab laseri valguse jõudmist detektorisse). Külgsuunas hajumist mõõtev detektor registreerib seda suuremat signaali muutust, mida granulaarsem objekt kapillaari läbib (sest granulaarne objekt hajutab laseri valgust külgsuundades). Lisaks sellele kuuluvad mitmete voolutsütomeetrite koosseisu ka detektorid fluorestsentsi intensiivsuse mõõtmiseks. Need on kasulikud juhul, kui rakkude sisse või pinnale on lisatud fluorestseeruvad komponendid – kas geneetiliste modifikatsioonide tulemusena (nt fluorestsentsvalkudega ühendatud valgud) või siis antikehade abil (fluorestsentsmärgisega antikehad, mis seostuvad rakkude pinnal paiknevate retseptoritega).

Registreeritud signaalide alusel koostatakse graafik, mis näitab, kui palju teatud tunnustega objekte on proovi analüüsi käigus registreeritud. Graafiku ühel teljel on peaaegu alati objekti suurus ning teisel objekti granulaarsus; täiendava dimensioonina võib lisanduda ka fluorestsentsi intensiivsus. Sel viisil saab varasemate teadmiste najal analüüsida, milliseid objekte proov sisaldab – näiteks kasutatakse voolutsütomeetriat laialdaselt hematoloogilistes uuringutes, tegemaks kindlaks erinevate vererakkude populatsioonide olemasolu ja hulka vereproovis. Lisaks analüütilistele eesmärkidele, kasutatakse tsütomeetreid ka preparatiivsetel eesmärkidel, st püüdmaks proovist välja just teatud omadustega objekte (nt ainult fluorestseeruvaid rakke).

Antikehade kasutamisel põhinevad tehnikad

Antikehad on suured valgulised molekulid, mida loomade adaptiivne immuunsüsteem (ehk kohanev immuunsüsteem) toodab, tuvastamaks võõrorganismidest pärinevaid valke. Kuna antikeha ülesandeks on potentsiaalse haigustekitaja võimalikult selektiivne äratundmine, saab antikehi kasutada ka fundamentaalteaduses valkude tuvastamiseks keerulistes segudes. Kui näiteks soovitakse valmistada antikeha mõne inimorganismi valgu vastu, siis tuleb sellist antikeha toota mõne teise imetaja (nt küüliku või hiire) organismis, immuniseerides looma inimese valguga (nn antigeen).

Antikehade molekulmass oleneb antikeha konkreetsest tüübist, kusjuures levinumaks on immunoglobuliin G (IgG) molekulmassiga ligi 150 kDa. IgG struktuuris saab eristada kaks põhilist funktsionaalset osa: nn Fab fragment, mis seostub selektiivselt antigeeniga, ja Fc fragment, mis tagab IgG koospüsimist. Puhastatud IgG molekulis saab Fc fragmenti seejuures üsna selektiivselt keemiliselt muundada, ühendades IgG sel viisil näiteks fluorestsentsvärvi või suurema osakese/mikrotiiterplaadi süvendi pinnaga. Sel viisil muundatud antikehi kasutatakse antigeen-valkude selektiivseks tuvastamiseks eri meetodites:

• Immunoloogiline kapillaarülekanne (ingl k Western blot) – geelelektroforeesi järel kantakse valgud elektrivälja abiga üle õhukesele membraanile ning seejärel ilmutatakse membraanil analüüsitava valgu asukoht, kasutades selektiivset antikeha. Tuvastuse õigsust on võimalik kontrollida valgu teadaoleva molekulmassi alusel. Meetod on poolkvantitatiivne, võimaldades võrrelda valgu sisaldust eri proovides.
• Immunoensüümmeetod (ELISA) – on teostatav eri formaatides, millest tuntuim on nn võileib-ELISA (ingl k sandwich-ELISA). Mikroplaadi süvendisse kinnitatakse antikeha, seejärel lisatakse süvendisse analüüsitav homogeenne proov. Pärast inkubeerimist ja pinnaga seostumata jäänud proovi komponentide mahapesemist lisatakse veel üks antikeha, mis seostub analüüsitava valgu teise osaga (vältimaks konkurentsi pinnaga seotud antikehaga). Meetod on kvantitatiivne, kui kasutatakse sisestandardit (st analüüsitava valgu teadaoleva kontsentratsiooniga lahus). ELISA-st on ka modifikatsioone, sealhulgas kiirtestid, mille puhul on kvalitatiivne vastus (nt kas proovis leidub teatud viirusele omast valku) olulisem kvantitatiivsest.
• Immunohistokeemia (IHC) – proovina kasutatakse tahkeid koelõike, mida valmistatakse eluskoe parafiniseerimise või krüokülmutamise ja fikseerimise järel. Proovi eeltöötlus peab tagama valkude asukoha ja hulga säilimist, kuid seejuures blokeerima elussüsteemidele iseloomulikke protsesse (nt rakkude ainevahetus või jagunemine). Koelõigud värvitakse antikehaga, millele järgneb optiline mikroskoopia. Meetod on poolkvantitatiivne ning lubab tuvastada valgu sisaldust koes leiduvate rakkude eri populatsioonides ning valgu ligikaudset asukohta rakus (nt plasmamembraan, tsütosool või rakutuum). IHC-d kasutatakse laialdaselt patsientide koeproovide analüüsiks, tuvastamaks näiteks vähirakkude vohamise eest vastutavate valkude olemasolu.
• Immunotsütokeemia (ICC), mida nimetatakse sageli ka immunofluorestsentsiks (IF) – sarnaneb suuresti IHC-ga, kuid teostatakse rakukultuuris ettekasvatatud rakkude, mitte patsientidelt biopsia jaoks võetud koelõikudega. Meetod on poolkvantitatiivne ning lubab tuvastada valgu täpsemat asukohta rakus (eriti juhul, kui kasutatakse organellide markereid ja/või superlahutusmikroskoopia tehnikaid).

Antikehi saab toota ka translatsioonijärgselt modifitseeritud valgu või sellega sarnase peptiidi suhtes, et saadud antikeha tunneks eelistatult ära just sellist valgu vormi. Kõik antikehi kasutavad meetodid eeldavad antikeha suurt selektiivsust antigeeni suhtes, kuigi reaalsuses ei ole selektiivsus absoluutne. Tänapäeval on suur osa antikehadest kommertsiaalselt kättesaadav, kusjuures antikeha valikul tuleb arvestada ka tootja soovitusi meetodi osas, sest sama antikeha ei pruugi olla kasutatav eri tüüpi rakendusteks.

ProteomicsDB

ProteomicsDB on ühtaegu andmebaas ja repositoorium (ehk andmehoidla), kuhu on koondatud suur osa massispektromeetria abil tehtud proteoomikauuringute (publitseeritud) tulemustest. Andmebaasis on esindatud inimese, koduhiire, hariliku müürlooga ja hariliku riisi proteoomid, kusjuures inimese proteoomi katvus on 83,3% (4. detsembri 2022 seisuga). Andmebaasis on võimalik otsida proteoomika uuringutest selgunud infot konkreetsete valkude kohta (nt eri proteaaside lagundamisel tekkivate peptiidide täpne koostis ja molekulmass, aga ka valk-valk interaktsioonide kaardistamisel selgunud partnerid) ja tuntud ravimite kohta (st milliste rakusiseste protsessidega on proteoomi tasemel ravimid seotud ning millised on ravimite raporteeritud valgulised sihtmärgid). Andmebaasis sisalduvat infot on mugav alla laadida nt CSV-failidena ning mõningate andmete kohta pakutakse ka visualiseerimist pildina (nt valgu vastastikmõjude kaart või ravimi teadaolevad sihtmärgid).

Human Protein Atlas (HPA)

HPA keskendub inimese transkriptoomile ja proteoomile ja selle muutustele patoloogia (eriti vähkkasvajate) kontekstis. Kuigi proteoomika andmed ei ole kättesaadavad kõigi geenide jaoks (st mõningate geenide puhul on olemas vaid info mRNA tasemel), sisaldab HPA 7. detsembri 2022 seisuga infot 17291 valgu kohta, mille uurimiseks on kasutatud 27397 antikeha ning andmebaasi täiendatakse pidevalt (suuremaid värskendusi tehakse ligi poole aastat tagant).

Proteoomika meetoditest on HPA-s tugevalt esindatud immunohistokeemia (st info eri valkude sisalduse ja ligikaudse rakusisese lokalisatsiooni kohta inimkudedes) ja immunotsütokeemia (st info eri valkude sisalduse ja täpse rakusisese lokalisatsiooni kohta erinevates rakuliinides). Nii IHC kui ka ICC osas esitatakse hulgaliselt mikroskoopiapilte, mille juurde on märgitud ka konkreetse kasutatud antikeha kood ja tootja. Lisaks sisaldab HPA detailsemaid alajaotusi ajus, immuunsüsteemis ja veres sisalduvate valkude kohta. Samuti saab päringu ehitada elundi-, koe- või rakutüübi järgi, kus kuvatakse süsteemi teadaolevat proteoomi ja selle sarnasust teiste elundite/kudede/rakutüüpide proteoomiga.