Internal transcribed spacer (afgekort ITS) is een niet-eiwitcoderende DNA-sequentie die zich bevindt tussen genen voor ribosomaal RNA (rRNA). Bij eukaryoten bestaat de ITS-regio uit twee afzonderlijke delen, ITS1 en ITS2, die van elkaar worden gescheiden door het gen voor 5,8S-rRNA. De regio maakt deel uit van het ribosomale DNA (rDNA) in de celkern.
De ITS-regio wordt veel gebruikt in de moleculaire biologie, fylogenie en taxonomie. Vooral binnen de mycologie speelt deze DNA-sequentie een belangrijke rol bij het identificeren en onderscheiden van schimmelsoorten. Sinds 2012 geldt de nucleaire ribosomale ITS-regio als de belangrijkste gestandaardiseerde DNA-barcode voor schimmels.
Bij eukaryoten bestaat het ribosomale DNA uit herhaalde eenheden waarin de genen voor 18S-, 5,8S- en 25S/28S-rRNA liggen. Tussen deze genen bevinden zich de twee interne getranscribeerde spacers. Bij schimmels wordt de organisatie doorgaans als volgt weergegeven:
5′ — 18S — ITS1 — 5,8S — ITS2 — 28S — 3′De verschillende onderdelen zijn:
Met de volledige ITS-regio wordt in moleculair onderzoek doorgaans het gecombineerde fragment ITS1–5,8S–ITS2 bedoeld. Hoewel het 5,8S-gen zelf geen spacer is, wordt het vanwege zijn ligging tussen ITS1 en ITS2 gewoonlijk meegenomen bij de analyse.
De ITS-regio's worden tijdens de transcriptie samen met de ribosomale RNA-genen overgeschreven naar een lang precursor-rRNA. Dit RNA wordt vervolgens door verschillende enzymatische processen verwerkt tot de afzonderlijke, functionele rRNA-moleculen.
Tijdens deze verwerking worden ITS1 en ITS2 uit het precursor-RNA verwijderd. De spacersequenties maken daardoor geen deel uit van het rijpe ribosoom. Ze spelen wel een rol bij de verwerking en rijping van het ribosomale RNA.
De ITS-regio's evolueren doorgaans sneller dan de aangrenzende ribosomale RNA-genen. Daardoor kunnen tussen nauw verwante soorten verschillen bestaan in de nucleotidevolgorde en de lengte van de ITS-sequenties.
Deze variatie maakt de regio bruikbaar als moleculaire marker voor het onderscheiden van soorten. Tegelijkertijd zorgen de relatief geconserveerde aangrenzende sequenties ervoor dat de ITS-regio bij veel organismen met dezelfde of vergelijkbare primers kan worden vermenigvuldigd.
De ITS-regio is een van de belangrijkste moleculaire markers in het moderne onderzoek naar schimmels. De sequentie wordt gebruikt bij soortidentificatie, het vaststellen van verwantschappen en het onderzoeken van de biodiversiteit.
In 2012 onderzocht een internationaal consortium van mycologen verschillende DNA-regio's op hun bruikbaarheid als algemene barcode voor schimmels. Daaruit bleek dat ITS, ondanks beperkingen bij bepaalde taxonomische groepen, de beste combinatie bood van brede toepasbaarheid, succesvolle DNA-amplificatie en onderscheidend vermogen. Daarom werd ITS voorgesteld en vervolgens algemeen aanvaard als de primaire DNA-barcode voor het schimmelrijk.
Veel schimmelsoorten vertonen grote overeenkomsten in hun morfologische kenmerken. Vooral bij nauw verwante soorten kunnen kenmerken van de hoed, lamellen, sporen en cystiden elkaar gedeeltelijk overlappen.
Door de ITS-sequentie te bepalen, kunnen dergelijke soorten in veel gevallen van elkaar worden onderscheiden. Dit is onder meer van belang bij soortencomplexen en bij schimmels waarvan de morfologische kenmerken onvoldoende onderscheidend zijn.
Voor een betrouwbare identificatie wordt de verkregen sequentie vergeleken met referentiesequenties van eerder onderzochte en geïdentificeerde schimmels. Bij voorkeur worden hiervoor sequenties gebruikt die afkomstig zijn van typemateriaal of ander zorgvuldig gecontroleerd referentiemateriaal.
Een overeenkomst tussen twee ITS-sequenties vormt echter niet altijd voldoende bewijs dat de onderzochte exemplaren tot dezelfde soort behoren. Daarom worden bij taxonomisch onderzoek vaak ook microscopische, macroscopische en ecologische kenmerken betrokken.
Bij het bepalen van de ITS-sequentie wordt eerst DNA geïsoleerd uit schimmelmateriaal, bijvoorbeeld een vruchtlichaam, mycelium of een schimmelkweek.
Vervolgens wordt de gewenste DNA-regio met de polymerasekettingreactie (PCR) vermenigvuldigd. Hiervoor worden veelvuldig de primers ITS1 en ITS4 gebruikt, die zich richten op geconserveerde sequenties aan weerszijden van de ITS-regio.
Na amplificatie kan het DNA-fragment worden gesequencet. De verkregen nucleotidevolgorde wordt vervolgens vergeleken met bestaande sequenties in databanken. Bij veel schimmels omvat het volledige ITS-fragment ongeveer 500 tot 700 basenparen, hoewel de lengte per soort kan verschillen.
ITS-sequenties hebben een belangrijke bijdrage geleverd aan de ontwikkeling van de moleculaire systematiek. Onderzoek met DNA heeft aangetoond dat sommige traditioneel onderscheiden schimmelsoorten uit meerdere genetisch verschillende soorten bestaan.
Daarnaast zijn op basis van moleculaire gegevens soorten opnieuw ingedeeld en zijn verwantschappen tussen geslachten en families nader onderzocht.
Bij de reconstructie van evolutionaire verwantschappen wordt ITS regelmatig gecombineerd met andere genetische markers. Dit wordt een multilocusanalyse genoemd. Een dergelijke benadering is vooral nuttig wanneer de ITS-regio onvoldoende informatie bevat om nauw verwante soorten of hogere taxonomische groepen betrouwbaar te onderscheiden.
ITS wordt ook toegepast bij onderzoek naar schimmelgemeenschappen in bodem, water, planten en andere milieumonsters.
Met behulp van metabarcoding kunnen onderzoekers DNA-fragmenten van meerdere soorten uit één monster tegelijk analyseren. Hierdoor kunnen ook schimmels worden aangetoond waarvan geen zichtbare vruchtlichamen aanwezig zijn of die moeilijk in kweek zijn te brengen.
Deze methode wordt onder meer gebruikt bij onderzoek naar mycorrhiza, bodembiodiversiteit, endofytische schimmels en de samenstelling van microbiële gemeenschappen.
Voor de identificatie van schimmels op basis van ITS-sequenties worden verschillende openbare databanken gebruikt.
GenBank is een internationale databank waarin DNA-sequenties van uiteenlopende organismen worden opgeslagen. De databank wordt beheerd door het Amerikaanse National Center for Biotechnology Information (NCBI).
Het NCBI beheert daarnaast een specifieke verzameling gecontroleerde ITS-referentiesequenties voor schimmels binnen het RefSeq Targeted Loci Project.
Deze verzameling bevat voornamelijk sequenties die afkomstig zijn van typemateriaal. Daarbij wordt bijzondere aandacht besteed aan de juistheid van de wetenschappelijke naam, de herkomst van het materiaal en de kwaliteit van de DNA-sequentie.
Met behulp van BLAST kunnen nieuw verkregen DNA-sequenties worden vergeleken met sequenties in deze databanken.
UNITE is een gespecialiseerde databank voor de moleculaire identificatie van schimmels, met de nucleaire ribosomale ITS-regio als belangrijkste marker.
De databank bevat zowel sequenties van beschreven schimmelsoorten als sequenties van schimmels die nog niet formeel wetenschappelijk zijn beschreven.
Binnen UNITE worden vergelijkbare ITS-sequenties samengebracht in zogenoemde species hypotheses (SH's). Dit zijn groepen DNA-sequenties die op basis van hun overeenkomst vermoedelijk een soort of een genetisch afgebakende groep vertegenwoordigen. Ze zijn niet noodzakelijk gelijk aan formeel beschreven biologische soorten.
Aan dergelijke groepen worden stabiele identificatiecodes en DOI's toegekend, zodat onderzoekers er onafhankelijk van eventuele veranderingen in de taxonomische naamgeving naar kunnen verwijzen.
Hoewel ITS voor veel schimmelgroepen een geschikte moleculaire marker is, kent het gebruik ervan verschillende beperkingen.
Sommige nauw verwante schimmelsoorten bezitten identieke of vrijwel identieke ITS-sequenties. Daardoor kunnen ze met uitsluitend deze marker niet altijd betrouwbaar worden onderscheiden.
Dit probleem komt onder meer voor bij bepaalde soortencomplexen van Aspergillus, Fusarium en Penicillium.
Om dergelijke soorten te onderscheiden, kunnen aanvullende genetische markers noodzakelijk zijn. Veelgebruikte markers zijn:
Binnen een schimmelsoort kunnen verschillen bestaan tussen ITS-sequenties van afzonderlijke exemplaren. Bovendien bevat het ribosomale DNA doorgaans meerdere kopieën per genoom, waarvan de ITS-sequenties niet altijd volledig identiek zijn.
Deze zogenoemde intragenomische variatie kan de interpretatie van DNA-resultaten bemoeilijken.
Een vaste grens voor het percentage sequentieovereenkomst is daarom niet voor alle schimmelgroepen geschikt om soorten af te bakenen. De mate van genetische variatie binnen en tussen soorten verschilt per taxonomische groep.
Niet alle gebruikte ITS-primers werken even goed bij alle schimmelgroepen. Sommige primers hebben een grotere affiniteit voor bepaalde groepen, waardoor deze bij de PCR vaker worden vermenigvuldigd dan andere.
Vooral bij onderzoek naar gemengde schimmelgemeenschappen kan dit leiden tot een vertekend beeld van de aanwezige biodiversiteit.
Daarnaast kunnen fouten in referentiedatabanken, onjuist geïdentificeerd materiaal en ontbrekende referentiesequenties de betrouwbaarheid van een determinatie verminderen.
De ITS-regio is niet uniek voor schimmels. Ook bij andere eukaryoten, waaronder planten, dieren en verschillende groepen protisten, komen ITS1 en ITS2 voor.
Bij bacteriën en archaea kan een interne getranscribeerde spacer aanwezig zijn tussen de genen voor 16S-rRNA en 23S-rRNA. Deze regio wordt eveneens gebruikt bij moleculair onderzoek naar genetische diversiteit en verwantschappen, maar heeft een andere organisatie dan de ITS1–5,8S–ITS2-regio van eukaryoten.