Nacque nel Bronx (New York) dall'attore, comico, e regista Carl Reiner e dall'attrice Estelle Lebost, di famiglia ebraica; fu proprio il padre a spingerlo a iniziare la sua carriera nel cinema. Aveva una sorella, Sylvia "Annie" Anne, e un fratello, Lucas Joseph, entrambi minori. Quando ha tredici anni la famiglia si trasferisce a Los Angeles, dove frequenta l'Università della California. Iniziò le sue esperienze, come attore di film per la TV, ed è nel 1971 che si fa conoscere dal pubblico per la sua interpretazione del personaggio di Michael Stivic nella serie Arcibaldo, che gli farà vincere anche due Emmy Award.
Nel 1984 iniziò a dedicarsi alla regia, dirigendo il suo primo film dal titolo This Is Spinal Tap ma il suo talento di autore, esplose nella sua prima commedia brillante Harry, ti presento Sally.... Incominciò anche una collaborazione con Stephen King con i film Stand by Me - Ricordo di un'estate e Misery non deve morire e, nello stesso periodo, realizzò La storia fantastica. Grazie ai proventi dei suoi primi film di successo fondò una casa di distribuzione, la Castle Rock Entertainment, nome scelto in onore di Stephen King (Castle Rock è infatti il nome di una cittadina immaginaria inventata dallo scrittore), e proprio Misery non deve morire, tratto dal romanzo di King Misery, sarà una delle prime produzioni della neonata Castle Rock Entertainment.
Dal 1971 al 1981 fu sposato con l'attrice, regista e produttrice Penny Marshall adottandone la figlia Tracy, anche lei attrice, e dal 1989 alla morte con la fotografa Michele Singer con cui ebbe Jake (1991), Nick (1993) e Romy (1997).
Reiner è stato anche un attivista politico progressista che si è battuto per cause quali i diritti LGBT, istruzione prescolastica, e la tutela dell'ambientale, e che ha condotto campagne elettorali a sostegno di svariati candidati democratici. Reiner ha presieduto la campagna del 1998 per l'approvazione dell'iniziativa californiana "First 5" sull'istruzione infantile e, nel 2008, insieme alla moglie Michele, ha co-fondato l'American Foundation for Equal Rights, che ha avviato la causa legale contro il divieto di matrimonio tra persone dello stesso sesso in California.
Nonostante il successo, Reiner dovette affrontare problemi personali legati al figlio Nick, il quale lottò contro la tossicodipendenza e disturbi di salute mentale. Reiner ha diretto il film Being Charlie, di cui Nick aveva scritto la sceneggiatura.
Assassinio
Rob Reiner insieme al figlio Nick, principale sospettato dell'omicidio dei genitori
Il 14 dicembre 2025 Reiner, 78 anni, e la moglie Michelle Singer, 70 anni, furono rinvenuti morti all'interno della loro casa di Brentwood (Los Angeles), al 255 di South Chadbourne Avenue, entrambi uccisi a coltellate. La figlia più piccola della coppia, Romy, vi aveva fatto rientro insieme alla sua coinquilina dopo aver ricevuto una telefonata dalla massaggiatrice dei coniugi Reiner che, non riuscendo ad entrare nell'abitazione, le aveva chiesto di consegnarle le chiavi. Giunta sul posto la ragazza entrò in casa, dove scoprì il cadavere del padre con la gola recisa e numerose ferite di arma da taglio per poi fuggire via in lacrime, ignara che anche sua madre, anch'ella priva di vita, fosse presente all'interno. Fu quindi la sua compagna di stanza, che preferì restare anonima, a chiamare i vigili del fuoco in soccorso, alle 15:38 locali.
La polizia di Los Angeles arrestò in quello stesso giorno il figlio maggiore della coppia, Nick Reiner, in un parco pubblico vicino all'University of Southern California, con l'accusa di duplice omicidio. Secondo quanto dichiarato da fonti anonime vicine ai Reiner rilasciate al New York Times, la notte del 13 dicembre Rob e Nick avevano partecipato a un party organizzato da Conan O'Brien, durante il quale i due ebbero un'accesa discussione per via del comportamento molesto di Nick, in evidente stato di ebbrezza, verso gli altri ospiti ivi presenti. Rob Reiner e Michelle Singer sono stati cremati al Mount Sinai Memorial Park Cemetery di Hollywood Hills; i loro resti furono affidati all'altro figlio maschio, Jake, per la loro dispersione. Sui piani funebri della coppia è stato inizialmente mantenuto il più stretto riserbo, sino a quando Jake e Romy hanno rilasciato un comunicato confermando la già avviata pianificazione di una cerimonia pubblica e che i relativi dettagli sarebbero stati resi ufficiali in data futura.
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